四種小漿果漿汁活性成分及其抗氧化活性

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(中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東青島 266003)

小漿果是一種多汁肉質(zhì)單果,漿果類(lèi)果樹(shù)種類(lèi)很多,多分布于我國(guó)北方地區(qū),尤其是東北地區(qū)[1],除了具有獨(dú)特的鮮食風(fēng)味,還具有豐富的保健營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,具有抗氧化、抗癌、改善肝臟解毒等功效[2],是近些年來(lái)世界上發(fā)展最為迅速的“第三代”新興水果,受到市場(chǎng)的青睞與歡迎。其中藍(lán)莓(VacciniumSpp.)、樹(shù)莓(RubuscorchorifoliusL. f.)、花楸(SorbuspohuashanensisH.)、藍(lán)靛果忍冬(LoniceracaeruleaL.)、草莓(FragariaananassaDuch.)等小漿果富含水溶性色素如花青素,相比沙棘(HippophaerhamnoidesL.)、枸杞(LyciumbarbarumL.)的脂溶性色素更易被人體利用吸收,成為替代人工合成色素的潛力資源[3]。

我國(guó)藍(lán)莓栽培起始于20世紀(jì)80年代,期間藍(lán)莓產(chǎn)業(yè)發(fā)展突飛猛進(jìn),截止2017年底,我國(guó)藍(lán)莓種植面積達(dá)70余萬(wàn)畝,預(yù)計(jì)未來(lái)3～5年內(nèi),藍(lán)莓的種植面積將達(dá)300萬(wàn)畝,樹(shù)莓在國(guó)外栽培歷史悠久,但近年來(lái)中國(guó)的樹(shù)莓產(chǎn)量也逐年提高,尤其是華北與東北地區(qū)[4-5]。藍(lán)靛果和黑果腺肋花楸作為兩種新興的小漿果,由于較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及保健功能,近年來(lái)也引起了人們的注意。樹(shù)莓含有大量鞣花酸、單寧、槲皮素、沒(méi)食子酸、花青素等,具有抗氧化、延緩衰老、消除疲勞和抗癌等作用[6-7]。藍(lán)莓除了含常規(guī)的糖、酸、礦物質(zhì)元素和維生素外,還富含花青素、蛋白質(zhì)、超氧化物歧化酶(SOD)、熊果苷等成分,具有保護(hù)視力、延緩衰老、有效降低膽固醇、防止動(dòng)脈粥樣硬化、預(yù)防癌癥等功效[8-9]。藍(lán)靛果營(yíng)養(yǎng)豐富,富含糖類(lèi)、氨基酸、多酚、花青素等,具有抗病毒、抗癌、改善高血壓、抵御疲勞、抗氧化等功效[10]。黑果腺肋花楸含有多種維生素和礦物質(zhì),還富含黃酮、花青素和多酚等物質(zhì),對(duì)心腦血管疾病具有特殊療效,還具有抗炎、降血糖血脂、抗氧化等保健功能[11-12]。小漿果富含很多天然活性成分,有利于減少機(jī)體的損傷和疾病的發(fā)生,是活性氧清除的潛在來(lái)源,并逐漸成為小漿果研究的熱點(diǎn)[8]。

國(guó)內(nèi)小漿果大多以?xún)龉问匠隹诤Ｍ馐袌?chǎng),目前在小漿果的栽培和繁育技術(shù)上研究報(bào)道很多,針對(duì)小漿果的高值化研究還不足。本實(shí)驗(yàn)選取了兩種目前市場(chǎng)上火熱的小漿果藍(lán)莓和樹(shù)莓以及兩種新興小漿果藍(lán)靛果和黑果腺肋花楸作為研究對(duì)象,通過(guò)酶法制備成漿汁,對(duì)其多酚、SOD、花色苷及總黃酮含量進(jìn)行考察,以維生素C做陽(yáng)性對(duì)照,采用不同的自由基清除體系及脂質(zhì)過(guò)氧化探討了其抗氧化活性,并對(duì)活性成分含量與抗氧化活性相關(guān)性分析,以期為功能性產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù),能使其廣泛應(yīng)用于功能食品、醫(yī)療保健及化妝品行業(yè)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藍(lán)靛果、樹(shù)莓、藍(lán)莓、黑果腺肋花楸漿果 均購(gòu)自東北長(zhǎng)白山,鮮果成熟采摘后冷凍保存;果膠酶(酶活力為60000 U/mL)和β-葡萄糖苷酶(酶活力為4000 U/mL) 寧夏夏盛實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司;蘆丁 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)制劑有限責(zé)任公司;Folin-Ciocalteu試劑、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)和鄰苯三酚 Sigma公司;抗壞血酸、水楊酸、無(wú)水乙醇、甲醇、FeSO4、Tris堿、沒(méi)食子酸、CH3COONa、EDTA·2Na等 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

L5S紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海儀電分析儀器有限公司;ESH105電子水分測(cè)定儀 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司;L530離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司;HWS24型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;THZ-82A水浴恒溫振蕩器 蘇州威爾實(shí)驗(yàn)用品有限公司;BXS07-WYA-2S數(shù)字阿貝折射儀 北京北信科遠(yuǎn)儀器有限責(zé)任公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的處理 將冷凍保存的四種小漿果于常溫下自然解凍30 min后,按照實(shí)驗(yàn)室之前優(yōu)化的最佳酶解工藝,向鮮果中加入質(zhì)量比1∶1的蒸餾水、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.02%的果膠酶和0.1%β-葡萄糖苷酶,在38 ℃下不斷攪拌復(fù)合酶解3 h完成后于4000 r/min離心20 min,得到上清即為小漿果漿汁樣品。

1.2.2 固形物含量的測(cè)定 根據(jù)NY/T 2637-2014[13]測(cè)定漿果中固形物含量來(lái)確定質(zhì)量濃度。取2～3滴漿果漿汁均勻分布于棱鏡表面,對(duì)準(zhǔn)光源,記錄折射儀讀數(shù)。

1.2.3 多酚含量的測(cè)定 采用GB/T 31740.2-2015[14]對(duì)茶多酚含量檢測(cè)方法。分別取1 mL沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)液、水(空白對(duì)照)及四種漿果漿汁與5 mL的Folin-Ciocalteu試劑充分混勻,靜置3～8 min后加入4 mL 7.5% Na2CO3水溶液混勻,60 min后,在765 nm下測(cè)定樣液吸光值。以沒(méi)食子酸作為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)來(lái)定量小漿果中多酚,得到回歸方程y=0.0132x+0.039,R2=0.9996,其中y代表吸光度,x代表沒(méi)食子酸濃度(μg/mL),計(jì)算多酚含量。

式中,A為765 nm處的吸光值;SLOPEstd為沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的斜率;d為稀釋因子。

1.2.5 花色苷含量的測(cè)定 根據(jù)花色苷特有性質(zhì),參照pH示差法[16]稍作修改來(lái)測(cè)定樣品中花色苷含量。四種小漿果漿汁分別用pH1.0的氯化鉀緩沖溶液(0.2 mol/L KCl∶0.2 mol/L HCl=25∶67)和pH4.5的醋酸鈉緩沖溶液(1 mol/L CH3COONa∶1 mol/L HCl∶H2O=100∶60∶90)稀釋10倍,對(duì)應(yīng)空白組以溶劑代替樣品,在510 nm和700 nm處測(cè)吸光值。以矢車(chē)菊-3-葡萄糖苷表示總花色苷含量,計(jì)算公式如下:

A=(A510-A700)pH1.0-(A510-A700)pH4.5

式中,C為花色苷含量,mg/g;A510為510 nm處吸光值,A700為700 nm處吸光值;n為稀釋倍數(shù);449為矢車(chē)菊-3-葡萄糖苷的相對(duì)分子質(zhì)量;29600為矢車(chē)菊-3-葡萄糖苷的消光系數(shù)。

1.2.6 總黃酮含量的測(cè)定 參照GB/T 20574-2006,采用NaNO2-Al(NO3)3比色法測(cè)定總黃酮含量[17]。以蘆丁為標(biāo)樣,在堿性條件下于510 nm處測(cè)定顯色液的吸光度確定樣液中總黃酮的含量。分別吸取四種小漿果漿汁2 mL和30%乙醇溶液3 mL于試管中,加入5% NaNO2溶液0.3 mL搖勻,放置6 min后加入10% Al(NO3)3溶液0.3 mL搖勻,6 min后加入1 mol/L NaOH溶液4 mL,加水0.4 mL搖勻,于510 nm下測(cè)定吸光值,同時(shí)以2 mL樣液和8 mL乙醇溶液作為對(duì)照溶液,空白組將樣液替換成乙醇溶液。根據(jù)吸光值,利用蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)來(lái)計(jì)算樣品中總黃酮的含量,得到回歸方程y=1.2028x-0.0111,R2=0.9998,其中y代表吸光度,x代表蘆丁濃度,mg/mL,計(jì)算總黃酮含量。

總黃酮含量(mg/mL)=Y×n

式中,Y為從回歸方程求得的蘆丁濃度,mg/mL;n為樣液稀釋倍數(shù);V為樣品體積,mL。

1.2.7 ·OH自由基的清除 參考Li等[18]的方法來(lái)測(cè)定樣品對(duì)羥自由基的清除效果。向試管中加入1 mL FeSO4(9 mmol/L)、1 mL水楊酸-乙醇(9 mmol/L)和1 mL不同濃度的四種小漿果漿汁及VC溶液,隨后加入1 mL H2O2(8 mmol/L)啟動(dòng)反應(yīng),渦旋混勻后于37 ℃水浴鍋反應(yīng)30 min,在510 nm下測(cè)定吸光值。對(duì)·OH自由基的清除作用公式如下:

式中,Ai為樣品吸光值,Ai0為以蒸餾水代替H2O2測(cè)定的樣品本底吸收值,A0為以蒸餾水代替樣品溶液測(cè)定的空白對(duì)照吸光值。

式中,Ai為樣品吸光值,Ai0為測(cè)定的樣品本底吸收值,A0為以蒸餾水代替樣品溶液測(cè)定的空白對(duì)照吸光值。

1.2.9 DPPH·自由基的清除 根據(jù)Carmona-Jimenez等[21]和Marecek等[22]的方法測(cè)定樣品對(duì)DPPH·自由基清除活性。向試管中加入2 mL DPPH溶液(2 mmol/L,甲醇配制)和2 mL不同濃度的四種小漿果漿汁及VC溶液,渦旋混勻,于室溫黑暗條件下反應(yīng)30 min,于517 nm下測(cè)定吸光值。對(duì)DPPH·自由基的清除作用公式如下:

式中,Ai為2 mL DPPH溶液+2 mL樣品溶液的吸光值,Ai0為2 mL樣品溶液+2 mL甲醇的本底吸光值,A0為2 mL DPPH溶液+2 mL甲醇的吸光值。

1.2.10 抗卵黃脂蛋白過(guò)氧化 按照趙麗[23]的方法,采用Fe2+誘發(fā)脂質(zhì)體的氧化來(lái)驗(yàn)證抗脂質(zhì)過(guò)氧化功能。向試管中加入0.1 mL稀釋至25倍的卵黃懸液(用pH7.45,0.1 mol/L 的PBS配制),加入不同濃度的四種小漿果漿汁及VC溶液,加入0.1 mL FeSO4·7H2O溶液(25 mmol/L),隨后用PBS補(bǔ)足至2 mL。其對(duì)照組不加樣品溶液,其他同上。在37 ℃下水浴振蕩15 min。然后加入0.5 mL 20%的三氯乙酸,靜置10 min,在3500 r/min下離心10 min,取2 mL上清液加入1 mL 0.8%的硫代巴比妥酸,在100 ℃下沸水浴15 min,冷卻后在532 nm下測(cè)定吸光值,用PBS調(diào)零。對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制作用公式如下:

式中,A0為空白對(duì)照液的吸光值,Ai為加入樣品溶液后的吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,組間比較采用單因素方差分析,兩組均數(shù)之間采用q檢驗(yàn),實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,結(jié)果取平均值。相關(guān)性及顯著性分析采用SPSS 22統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 四種小漿果漿汁的固形物含量

藍(lán)靛果、樹(shù)莓、藍(lán)莓、黑果腺肋花楸四種小漿果按照相同的制備方式得到漿汁樣品,測(cè)得可溶性固形物含量依次為153.2、116.1、188.1和127.2 mg/mL,后續(xù)的活性實(shí)驗(yàn)通過(guò)將其稀釋合適的倍數(shù)得到的固形物含量來(lái)作為參與反應(yīng)的質(zhì)量濃度。

2.2 四種小漿果漿汁活性成分比較

四種小漿果漿汁的活性成分研究結(jié)果見(jiàn)表1。四種小漿果漿汁的活性成分含量差異顯著(p<0.05),同時(shí),與樹(shù)莓、藍(lán)莓、黑果腺肋花楸相比,藍(lán)靛果的多酚、SOD活力、花色苷以及總黃酮含量都是最高的,有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道花青素-3-葡萄糖苷是漿果品種中最突出的花青素,Chen等人[24]發(fā)現(xiàn)藍(lán)靛果中花青素-3-葡萄糖苷含量高于其他漿果,如藍(lán)莓,黑莓和覆盆子,Hwang等人[25]也發(fā)現(xiàn)藍(lán)靛果提取物總多酚含量顯著高于花楸果和藍(lán)莓提取物,這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果是一致的,從表1的數(shù)據(jù)可以看出藍(lán)靛果的多酚、SOD酶和總黃酮是其他三種小漿果含量的1.5～7倍,花色苷(3.768 mg/mL)則是黑果腺肋花楸含量的14倍左右,說(shuō)明藍(lán)靛果含有更豐富的天然活性成分,凸顯了其在醫(yī)療、保健食品、化妝品行業(yè)中潛在的應(yīng)用價(jià)值。

表1 四種小漿果漿汁活性成分含量Table 1 Active components content of four kinds of small berry juices

2.3 四種小漿果漿汁體外抗氧化活性比較

2.3.1 ·OH自由基的清除能力 ·OH自由基被看作氧化代謝的有毒副產(chǎn)物,在生物體內(nèi)具有極高的反應(yīng)活性,是活性氧中最活潑的自由基,能夠?qū)е录?xì)胞代謝、功能和結(jié)構(gòu)的改變[26]。以VC為陽(yáng)性對(duì)照,四種小漿果漿汁對(duì)·OH自由基的清除效果如圖1所示,由圖可知,各漿果漿汁及VC對(duì)·OH自由基的清除率隨質(zhì)量濃度增加而增大,四種小漿果漿汁的清除活性存在一定的差異,效果均低于VC,VC對(duì)·OH自由基的IC50值為0.213 mg/mL(50%清除率所需樣品濃度),藍(lán)靛果、黑果腺肋花楸、樹(shù)莓和藍(lán)莓IC50值分別為2.066、3.017、11.208和9.641 mg/mL。當(dāng)加入的質(zhì)量濃度為4 mg/mL時(shí),藍(lán)靛果和黑果腺肋花楸對(duì)·OH自由基清除率可達(dá)到93.27%和70.45%,對(duì)·OH自由基清除效果具有明顯優(yōu)勢(shì)。

圖1 四種小漿果漿汁對(duì)·OH自由基的清除作用Fig.1 Scavenging effect of four kinds of small berry juices on OH radical

圖2 四種小漿果漿汁對(duì)自由基的清除效果Fig.2 Scavenging effect of four kinds of small

2.3.3 DPPH·自由基的清除能力 由圖3可以看出,四種小漿果漿汁對(duì)DPPH·自由基的清除率隨質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng),且具有明顯的量效關(guān)系,VC亦之。四種漿果漿汁之間清除活性存在一定差異,VC對(duì)DPPH·自由基的清除效果要優(yōu)于這四種小漿果漿汁,VC的IC50值為17.999 μg/mL,藍(lán)靛果、黑果腺肋花楸、樹(shù)莓和藍(lán)莓的IC50值分別為61.342、79.190、114.453和127.536 μg/mL。藍(lán)靛果和黑果腺肋花楸對(duì)DPPH·自由基具有良好的清除活性,當(dāng)質(zhì)量濃度為150 μg/mL時(shí),藍(lán)靛果和黑果腺肋花楸對(duì)DPPH·自由基的清除率可達(dá)到96.01%和86.94%。由于小漿果的漿汁仍只是粗提取,若做進(jìn)一步純化處理,將會(huì)縮小與VC的差距。

圖3 四種小漿果漿汁對(duì)DPPH·自由基的清除效果Fig.3 Scavenging effect of four kinds of small berry juices on DPPH radical

2.3.4 抗卵黃脂蛋白過(guò)氧化能力 脂質(zhì)過(guò)氧化會(huì)產(chǎn)生有細(xì)胞毒性的脂質(zhì)過(guò)氧化物,會(huì)破壞人體細(xì)胞正常生理功能,促使人體衰老和誘發(fā)癌癥。由圖4可知,以VC為陽(yáng)性對(duì)照,四種小漿果漿汁對(duì)卵黃脂蛋白過(guò)氧化均有抑制效果,且隨著質(zhì)量濃度的增大抗氧化活性也在增強(qiáng)。四種小漿果抗脂質(zhì)過(guò)氧化活性存在差異,當(dāng)質(zhì)量濃度為100 μg/mL時(shí),藍(lán)靛果、黑果腺肋花楸、樹(shù)莓和藍(lán)莓對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化抑制率分別為42.78%、29.35%、10.44%和6.91%,而相同質(zhì)量濃度下VC對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化抑制率為9.44%。隨著質(zhì)量濃度的增大,VC的抗氧化效果明顯增強(qiáng),而小漿果抑制氧化反而不夠明顯,可能是由于漿果漿汁本身的顏色干擾了吸光度的測(cè)定，從而影響了活性結(jié)果。藍(lán)靛果和黑果腺肋花楸具有較明顯的優(yōu)勢(shì),其中VC的IC50值為160.856 μg/mL,藍(lán)靛果、黑果腺肋花楸、樹(shù)莓和藍(lán)莓的IC50值分別為181.590、196.732、321.342和394.421 μg/mL。

圖4 四種小漿果漿汁抗脂質(zhì)過(guò)氧化效果Fig.4 Anti-lipid peroxidation effect of four kinds of small berry juices

表2 活性成分含量與抗氧化活性的相關(guān)性Table 2 Correlation between active components content and antioxidant activities

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)小漿果漿汁的活性成分比較研究中發(fā)現(xiàn)四種東北特產(chǎn)小漿果漿汁活性成分含量差異顯著(p<0.05),相比之下藍(lán)靛果含有更高含量的天然活性成分,藍(lán)靛果的多酚、SOD酶和總黃酮含量是藍(lán)莓,樹(shù)莓及黑果腺肋花楸的1.5～7倍,而花色苷含量則高達(dá)黑果腺肋花楸的14倍左右,這也符合藍(lán)靛果具有高花青素含量的文獻(xiàn)報(bào)道。

相關(guān)性分析表明，抗氧化能力與活性成分含量呈正相關(guān),除了SOD活力與·OH自由基清除率顯著相關(guān)(p<0.05)之外,其他均極顯著相關(guān)(p<0.01),相關(guān)系數(shù)表明，小漿果漿汁的這些活性成分可能為其抗氧化的基本物質(zhì)基礎(chǔ)。