消退素D1抑制NLRP3信號通路對DSS結腸炎小鼠的影響

方 晨，梅詠玉，王 晶，楊 彬，劉曉昌，許建明，梅 俏

(安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，安徽省消化病重點實驗室，安徽 合肥 230022)

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)是一種病因尚不完全明確的慢性腸道炎癥性疾病。IBD的發(fā)病機制可能與遺傳、感染、環(huán)境、免疫等因素有關，其中，黏膜免疫異常在IBD的持續(xù)腸道炎癥過程中具有重要作用[1]。

IBD治療的主要方向是恢復促炎因子與抗炎因子之間的平衡[1]，調節(jié)腸道黏膜免疫異常。在腸道免疫功能的調節(jié)過程中，炎癥小體的活化發(fā)揮重要影響，其中NOD樣受體家族3(NOD-like receptor protein 3, NLRP3)炎癥小體是目前研究最廣泛的炎癥小體，參與了炎癥性疾病的發(fā)生、發(fā)展。Zhang等[2]研究發(fā)現(xiàn)，NLRP3基因多態(tài)性與IBD風險增加有關。NLRP3炎癥小體是一種多蛋白復合物，負責IL-1β和IL-18的蛋白水解成熟和分泌。NLRP3炎癥小體由NLRP3、凋亡相關斑點樣蛋白[apoptosis associated speck-like protein containing a caspase activation and recruitment domain(CARD)，ASC]和胱天蛋白酶 1(caspase-1)組成，被激活時，NLRP3受體通過ASC聚合并募集和活化pro-caspase-1，活化的caspase-1切割無活性的pro-IL-1β和pro-IL-18，并以成熟形式分泌，加重IBD中腸道炎癥過程[3]。

炎癥消退是炎癥過程的重要調控機制，由一系列抗炎介質控制，其中消退素 D1(resolvin D1，RvD1)是體內(nèi)重要的促炎癥消退因子。RvD1最早由小鼠腹腔炎性滲出物中分離，是由ω3- 二十二碳六烯酸(DHA)衍生的內(nèi)源性抗炎和促進炎癥消退的脂質分子。RvD1發(fā)揮限制中性粒細胞黏附與浸潤、限制炎癥損傷等作用[4]。Bento等[5]、Norling等[6]在結腸炎、關節(jié)炎等方面研究均證明RvD1可以改善組織炎癥，保護相關器官功能，但RvD1抗結腸炎的具體機制尚不十分清楚。因此，本研究通過探討RvD1對結腸炎小鼠腸道炎癥過程中NLRP3信號通路的影響，為RvD1抗結腸炎作用提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1實驗動物C57BL/6小鼠32只，♂，6～8周齡，體質量(18～22) g，購自安徽省動物中心，No.34000200001280。實驗前適應性飼養(yǎng)1周，溫度(20～26) ℃，相對濕度40%～70%。

1.2試劑葡聚糖硫酸鈉(dextran sodium sulfate, DSS)，美國Sigma公司；RvD1，美國Cayman公司；髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)試劑盒，南京建成生物工程研究所；IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α試劑盒，均購自武漢新啟迪生物科技有限公司；抗誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)、NLRP3、ASC、caspase-1 p20、IL-1β、pro-IL-1β抗體，均購自Bioss生物科技有限公司；抗β-actin抗體，北京中杉生物科技有限公司；DNA合成試劑盒，美國Thermo Scientific公司；QuantiNova SYBR Green PCR試劑盒，德國Qiagen公司。

1.3儀器EPS 300型電泳儀(上海天能科技有限公司)；TS-1000水平搖床(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；K960型PCR儀(杭州晶格科學儀器有限公司)；PikoReal 96型熒光定量PCR儀(Thermo Scientific公司)；高速臺式冷凍離心機(安徽嘉文儀器裝備有限公司)；Elx800型酶標儀(美國 Bio-Tek公司)；752N型可見紫外分光光度計(上海精密科學儀器有限公司)。

2 方法

2.1模型的制備與實驗分組按Chu等[7]方法，使用DSS建立小鼠實驗性結腸炎模型。實驗分為4組：A組為正常組，小鼠自由飲水，并腹腔注射生理鹽水；B組為RvD1對照組，小鼠自由飲水并腹腔注射RvD1；C組為DSS模型組，小鼠給予5% DSS溶液自由飲用，并腹腔注射生理鹽水；D組為RvD1給藥組，小鼠給予5% DSS溶液自由飲用，并腹腔注射RvD1。將RvD1溶于生理鹽水，分別于d 2、4、6進行小鼠腹腔注射(50 μg·kg-1)。實驗d 8處死所有小鼠，分離血清于-80 ℃保存，同時收集小鼠小腸和結腸組織，待測樣品液氮儲存。

2.2結腸炎程度評估實驗期間每天觀察小鼠體質量、大便性狀和便血情況，進行疾病活動指數(shù)(disease activity index，DAI)評分[8]。大便隱血檢測采用潛血檢測試紙進行。將取出的結腸組織用福爾馬林固定并石蠟包埋，切片厚4 μm，HE染色，進行組織學指數(shù)(histological index，HI)評分[9]。用生理鹽水制備10%結腸組織勻漿。按ELISA試劑盒說明，檢測結腸組織勻漿中MPO活性。

2.3小腸黏膜通透性檢測按文獻方法[10]制備小腸腸囊，注入伊文思藍0.2 mL，置于20 mL Krebs液燒杯中，95% O237 ℃水浴，30 min后取出腸囊組織，生理鹽水沖洗腸腔，37 ℃干燥，加入1 mL甲酰胺溶液，50 ℃孵育24 h，取出腸組織，溶液離心沉淀，取上清液進行紫外分光光度計檢測，檢測波長為655 nm。

2.4透射電鏡觀察將小腸組織于2.5%戊二醛中4 ℃固定6 h，1%鋨酸固定，梯度濃度乙醇脫水，環(huán)氧樹脂包埋，70 nm切片，JEM-1230F電子顯微鏡觀察小鼠小腸黏膜上皮細胞連接情況。

2.5結腸組織中IL-1、IL-6、IL-10和TNF-α水平測定按ELISA試劑盒說明書，檢測小鼠結腸組織中IL-1、IL-6、IL-10和TNF-α水平。

2.6Westernblot檢測結腸組織中相關蛋白的表達從結腸組織中提取蛋白質，使用SDS-PAGE分離，并轉移至PVDF膜。在室溫下用封閉液(5%脫脂乳)封閉2 h。將膜與一抗在4 ℃孵育過夜，一抗包括ASC、NLRP3、caspase-1、IL-1β、pro-IL-1β、iNOS(1 ∶300)及β-actin(1 ∶1 000)。TBST洗滌，將HRP連接的二抗在室溫下與膜孵育2 h。再次洗滌，使用ECL蛋白質印跡檢測系統(tǒng)和ImageJ軟件檢測分析結果。

2.7qPCR檢測小鼠結腸組織IL-1β、iNOSmRNA表達使用TRIzol試劑從巨噬細胞和結腸組織中提取總RNA。用RevertAidTMM-MuLV逆轉錄酶進行逆轉錄，合成DNA第一鏈，并按DNA合成試劑盒的說明，將RNA逆轉錄成cDNA。使用QuantiNova SYBR Green PCR試劑盒擴增獲得的cDNA用于定量PCR。以β-actin作為內(nèi)參，測量目的基因相對表達。引物序列(正向和反向)為：β-actin：5′-AGTGTG ACGTTGACATCCGT-3′和5′-TGCTAGGAGCCAGAG CAGTA-3′; iNOS：5′-CCTTGTTCAGCTACGCCTTC-3′和5′-CTTCAGAGTCTGCCCATTGC-3′; IL-1β：5′-GA AGAAGAGCCCATCCTCTG-3′和5′-TCATCTCGGAGC CTGTAGTG-3′。

3 結果

3.1RvD1對結腸炎小鼠腸道炎癥的影響與正常組小鼠相比，模型組小鼠DAI評分、HI評分、MPO水平明顯升高(Fig 1A、1B、1C)，病理可見結腸中大量中性粒細胞浸潤，隱窩明顯減少，并累及部分上皮細胞(Fig 1D)；RvD1組小鼠DAI評分、HI評分及MPO水平明顯降低，病理可見結腸中性粒細胞浸潤減少，隱窩數(shù)量基本正常，表明RvD1可以改善DSS結腸炎小鼠中結腸炎癥損傷程度。

3.2RvD1對結腸炎小鼠腸黏膜屏障功能的影響如Fig 2所示，與正常組小鼠相比，模型組小鼠小腸腸囊中伊文思藍濃度明顯上升，電鏡可見小腸上皮細胞絨毛雜亂，密度不均，細胞間連接增寬；RvD1組小鼠小腸腸囊中伊文思藍濃度降低，電鏡可見上皮絨毛稍稀疏，但排列規(guī)整，細胞間隙基本正常，表明RvD1可改善DSS引起的小鼠小腸結構和功能破壞。

3.3RvD1對結腸炎小鼠結腸組織勻漿IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α水平的影響Tab 1結果顯示，與正常組小鼠相比，模型組小鼠結腸組織中IL-1、IL-6、TNF-α水平增高，IL-10水平降低；與模型組小鼠相比，RvD1組小鼠結腸組織中IL-1、IL-6、TNF-α水平降低，IL-10水平增加。提示RvD1可調節(jié)DSS結腸炎小鼠腸黏膜中細胞因子水平，發(fā)揮抗結腸損傷作用。

Fig 1 Effect of RvD1 on colonic inflammation in DSS-induced colitis

A:DAI scoring; B: HI scoring; C: MPO activity; D: Histopathologic features of the colon. a: Normal group; b: RvD1 control group; c: Model group;d: RvD1 group.*P<0.05vsnormal group;#P<0.05vsmodel group.

3.4RvD1對DSS結腸炎小鼠結腸組織中NLRP3炎癥小體表達的影響通過Western blot及qPCR檢測結腸炎小鼠結腸NLRP3炎癥小體相關標志物，包括ASC、NLRP3、IL-1β、pro-IL-1β、iNOS、caspase-1 p20。如Fig 3所示，與正常組小鼠比較，模型組小鼠結腸中ASC、NLRP3、IL-1β、pro-IL-1β、iNOS、caspase-1p20水平升高；與模型組小鼠比較，RvD1組小鼠結腸中ASC、NLRP3、IL-1β、pro-IL-1β、iNOS、caspase-1 p20水平降低。表明RvD1可降低NLRP3炎癥小體信號通路中主要標志物的表達水平，改善結腸炎小鼠腸道炎癥程度。

Fig 2 Effect of RvD1 on intestinal barrier function and structure in DSS-induced colitis mice

*P<0.05vsnormal group,#P<0.05vsmodel group

Tab 1 Effect of RvD1 on contents of IL-1, IL-6, IL-10 and TNF-α in DSS-induced colitis

*P<0.05vsnormal;#P<0.05vsmodel

4 討論

IBD治療藥物包括氨基水楊酸制劑、糖皮質類激素、免疫抑制劑和各種生物制劑(如TNF-α單抗等)，這些藥物長期使用會引起明顯的副作用，如激素依賴、骨髓抑制和嚴重感染。因此，探討更為安全有效的抗結腸炎藥物是目前IBD研究的熱點之一。

RvD1作為消退素家族中的一員，在體內(nèi)起到重要的抗炎作用，其機制與限制中性粒細胞黏附與浸潤有關[4]。相關研究證實RvD1具有改善組織炎癥，保護器官功能的作用[5-6]，但RvD1抗結腸炎的具體機制尚不十分清楚。本研究結果顯示，腹腔注射RvD1可明顯降低實驗性結腸炎小鼠的DAI和HI評分，降低結腸組織中MPO水平。同時發(fā)現(xiàn)RvD1具有維持腸上皮完整性和通透性的作用。表明RvD1可以有效改善實驗性小鼠結腸炎的炎癥損傷。另外，RvD1可以降低結腸組織中IL-1、IL-6、TNF-α水平，升高IL-10水平，發(fā)揮調節(jié)細胞因子水平的作用。

IL-1β在結腸炎癥的促炎因子釋放中起重要作用，可以上調IL-6、TNF-α等促炎因子的表達，擴大和加重結腸炎癥損傷。NLRP3炎癥小體作為IL-1β成熟釋放的關鍵信號通路[11]，在腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)和炎癥中起重要作用，有研究顯示DSS可以激活巨噬細胞NLRP3炎癥小體，用DSS或TNBS處理的NLRP3-/-小鼠結腸炎癥減輕，結腸組織中促炎細胞因子水平較低[12-13]。本研究發(fā)現(xiàn)，DSS模型組中NLRP3、ASC、caspase-1 p20表達量均明顯增加， IL-1β、iNOS水平增加；RvD1可以降低結腸炎小鼠結腸組織中NLRP3、ASC、caspase-1 p20、IL-1β、iNOS表達，表明RvD1具有通過抑制NLRP3炎癥小體的活化，抑制促炎因子合成，改善小鼠結腸炎癥的作用。目前，有關NLRP3炎癥小體在實驗性結腸炎中的作用存在一定爭論。有研究顯示，NLRP3-/-小鼠對實驗性結腸炎更敏感[14-15]，原因可能為NLRP3作為先天性免疫的的重要組成部分，起到維持腸內(nèi)穩(wěn)態(tài)的關鍵作用，當NLRP3功能缺失，造成腸道微生物紊亂引起的黏膜損傷，是IBD可能的致病機制之一，經(jīng)過抗生素處理的NLRP3-/-小鼠結腸炎癥減輕[15]。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)RvD1可以減輕DSS結腸炎小鼠結腸炎癥的嚴重程度，保護腸道屏障功能，其機制可能與抑制NLRP3炎癥小體活化，調控促炎細胞因子表達有關，提示RvD1可作為治療IBD治療的潛在候選藥物。