安介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法對(duì)蝦醬中致病菌檢測(cè)結(jié)果的分析

林青

（海南省食品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，海南?？?70314）

傳統(tǒng)國(guó)標(biāo)方法中食品的致病菌檢測(cè)需要5～7天，對(duì)于海南博鰲年會(huì)或上海世博會(huì)等短期的會(huì)議活動(dòng)而言檢驗(yàn)時(shí)限太長(zhǎng)，已經(jīng)不能滿足會(huì)議食品安全保障的需要?，F(xiàn)今針對(duì)食源性致病菌快速檢測(cè)的方法有：免疫磁珠法[1-3]、MALDI-TOF MS法[4]、恒溫?zé)晒?PCR法[5]、拉曼光譜法[6]、實(shí)時(shí)熒光定量PCR法[7]等。恒溫?zé)晒釶CR全稱(chēng)是環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP），采用恒溫?cái)U(kuò)增DNA技術(shù)，通過(guò)Bst聚合酶及特異性引物在恒溫條件下對(duì)致病菌核酸片段進(jìn)行特異性擴(kuò)增，擴(kuò)增后產(chǎn)物DNA與核酸染料結(jié)合發(fā)出熒光信號(hào)，最后根據(jù)所產(chǎn)生的擴(kuò)增曲線判斷結(jié)果。LAMP技術(shù)反應(yīng)程序在63℃條件反應(yīng)45～60min后可以將少量的靶核酸分子擴(kuò)增到106分子水平。

本實(shí)驗(yàn)采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法快速檢測(cè)海鮮制品蝦醬中的沙門(mén)氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌和大腸桿菌O157等5種常見(jiàn)致病菌。

1 材料與方法

1.1 材料

所有樣品來(lái)源于送檢樣品。

1.2 試劑

細(xì)菌基因組DNA快速提取試劑盒、沙門(mén)氏菌核酸檢測(cè)試劑盒、志賀氏菌核酸檢測(cè)試劑盒、金黃色葡萄球菌核酸檢測(cè)試劑盒、副溶血性弧菌核酸檢測(cè)試劑盒、大腸桿菌O157核酸檢測(cè)試劑盒購(gòu)于廣州迪澳生物科技有限公司。

1.3 儀器

MMK金屬浴、Deaou-308C恒溫?zé)晒鈹U(kuò)增儀（廣州迪澳生物科技有限公司）。

1.4 檢測(cè)方法

實(shí)驗(yàn)樣品根據(jù)國(guó)家GB4789系列標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行前增菌，然后按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明提取模版DNA，將含有模版DNA的提取液加入核酸檢測(cè)試劑盒中，同時(shí)加入陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，然后上機(jī)檢測(cè)。

圖1

2 結(jié)果與分析

陰性和陽(yáng)性對(duì)照結(jié)果正常，樣品結(jié)果顯示副溶血性弧菌疑似陽(yáng)性，沙門(mén)氏菌、金葡菌及大腸桿菌O157等致病菌為陰性，詳見(jiàn)圖1。

對(duì)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法檢測(cè)出的副溶血性弧菌陽(yáng)性樣品按國(guó)標(biāo)4789.7-2013方法檢測(cè)檢出溫和氣單胞菌、棲稻假單胞菌。針對(duì)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)顯示致病菌陽(yáng)性，而國(guó)標(biāo)方法未檢出這一情況分析存在以下可能：一是樣品中可能存在一定量非存活的致病菌。致病菌不是活菌，因此常規(guī)檢驗(yàn)不能被培養(yǎng)出來(lái)，但環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法的原理是在細(xì)菌DNA擴(kuò)增的基礎(chǔ)上利用熒光信號(hào)而顯示結(jié)果，所以雖然是死菌，但仍然能被檢出[8]。二是蝦醬是高鹽分產(chǎn)品，快速提取的DNA模板可能含有較高的離子濃度，從而影響PCR體系而導(dǎo)致出現(xiàn)了假陽(yáng)性的可能。

3 結(jié)論

對(duì)于某些樣品檢驗(yàn)時(shí)應(yīng)充分考慮樣品特性，可選擇多樣的檢測(cè)手段，防止假陽(yáng)性結(jié)果的產(chǎn)生。作為一種新的技術(shù)手段恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)具有檢測(cè)速度快、檢測(cè)成本較低、檢測(cè)時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，能加快傳統(tǒng)方法檢測(cè)致病菌的速度，滿足食品快速通過(guò)的檢驗(yàn)要求，值得推廣使用。