冬凌草甲素可逆共價(jià)分子印跡聚合物的制備及其性能研究

黃少梅 張亞楠 楊萬里 何建峰

（1佛山市第三人民醫(yī)院 廣東 佛山 528041）

（2廣州康盛生物科技有限公司 廣東 廣州 510663）

（3廣州中醫(yī)藥大學(xué) 廣東 廣州 510006）

冬凌草甲素是冬凌草中抗癌效果最強(qiáng)的成分，且副作用小，它在癌癥方面的治療作用[1]已經(jīng)引起人們的高度重視。分子印跡技術(shù)是一種制備對模板分子具有高度識別能力聚合物的技術(shù)。制備過程簡單，制備的聚合物性質(zhì)穩(wěn)定，因此在藥物分離，固相萃取，生物傳感器等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用[2]。本研究用冬凌草甲素作為模板分子，4-乙烯基苯硼酸為功能單體，采用可逆共價(jià)結(jié)合方式制備對冬凌草甲素具有高度識別能力的分子印跡聚合物。

1.試劑及儀器

冬凌草甲素（Oridonin，規(guī)格98%，澤朗植提）；4-乙烯基苯硼酸（規(guī)格80%，天津阿法埃莎化學(xué)有限公司）；二乙烯基苯（DVB，AR，上海阿拉丁試劑有限公司，使用前減壓蒸餾）；其他試劑均為AR。

2.實(shí)驗(yàn)部分

2.1 冬凌草甲素共價(jià)印跡聚合物的的制備

稱取0.0365g（0.1mmol）冬凌草甲素模板分子，0.0140g（0.1mmol）功能單體4-乙烯基苯硼酸，溶于30mL 1，4-二氧六烷（H2SO4作為催化劑）于88℃下攪拌回流1h，5000rpm-1離心30分鐘，用少量甲醇洗后干燥得預(yù)聚體。將預(yù)聚體溶液轉(zhuǎn)入到試管中，依次加入0.746g(5.73mmol)DVB或0.547g(2.76mmol)乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA，0.01g 0.06mmol)偶氮二異丁腈（AIBN）及2.0mL的1，4-二氧六烷，然后通氮10min，密封后置于65℃水浴中恒溫反應(yīng)36h。反應(yīng)得到白色塊狀聚合物，將聚合物研磨并過120目篩，得聚合物微粒。用甲醇-鹽酸(pH=3)(v/v，7∶3)洗脫，直至抽提液經(jīng)紫外檢測無模板分子吸收為止。得到的分子印跡聚合物（MIP）在65℃下真空干燥24h，備用。

空白聚合物NIP的制備方法同上，但不加模板分子。

2.2 分子印跡聚合物的性能研究

2.2.1 動力學(xué)吸附研究 準(zhǔn)確稱取六份10mg MIP置于10mL磨口錐形瓶中，分別加入2mL 2mmol·L-1冬凌草甲素的甲醇-磷酸緩沖液（pH=7.40）(v/v，7∶3)標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于磁力攪拌器中攪拌，分別于5min、15min、30min、1h、3h、5h收集樣品，用0.22μm微孔濾膜過濾，經(jīng)紫外光度法檢測濾液中待測物的濃度，計(jì)算出聚合物在各時(shí)間點(diǎn)對模板分子的吸附量Q（μmol·g-1）。

2.2.2 聚合物的底物選擇性研究 準(zhǔn)確稱取五份10mg MIP和NIP分別置于10mL磨口錐形瓶中，分別加入2mL 2mmol·L-1冬凌草甲素、5-氟尿嘧啶、氯霉素、苯基-1，2-乙二醇、茶堿的甲醇-磷酸緩沖液（pH=7.40）(v/v，7∶3)標(biāo)準(zhǔn)溶液，室溫下攪拌24h，用0.22μm微孔濾膜過濾，經(jīng)紫檢測濾液中待測物的濃度，計(jì)算出聚合物對模板分子的吸附量Q（μmol·g-1）。

3.結(jié)果與討論

3.1 MIP洗脫條件探討

聚合物中冬凌草甲素和功能單體是以可逆共價(jià)鍵的方式結(jié)合的，性質(zhì)較穩(wěn)定。經(jīng)過查閱相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，甲醇-水溶液和pH=3.0的鹽酸對酯鍵的水解具有促進(jìn)作用，因此對洗脫條件進(jìn)行以下探討：首先，采用甲醇-鹽酸（pH=3.0）(v/v，1∶1)在常溫下攪拌洗脫24h，通過紫外分光光度計(jì)檢測發(fā)現(xiàn)洗脫率較低。隨后將聚合物于60℃攪拌回流，洗脫率明顯增加，結(jié)合冬凌草甲素在水中的溶解度較低，研究最后采用甲醇-鹽酸緩沖液（pH=3.00）(v/v，7∶3)為洗脫劑，于60℃攪拌回流，其洗脫率最高。

3.2 MIP結(jié)構(gòu)表征

MIP（洗脫前）IR數(shù)據(jù)（3438.56，1723.30，1141.64，1071.06，989.04cm-1）；MIP（洗脫后）IR數(shù)據(jù)（3441.30，1138.18，1068.77，992.33cm-1）。對照兩者紅外光譜數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，未洗脫的MIP存在一個(gè)羰基峰（1723.30cm-1），即模板分子冬凌草甲素的羰基峰，洗脫干凈的MIP的紅外光譜圖上未出現(xiàn)冬凌草甲素羰基峰。結(jié)果顯示，MIP中的模板分子被完全洗脫液徹底去除。此外，空白聚合物的紅外光譜圖，NIP：IR（3437，1152.06，1075.25，989.10cm-1），由于空白聚合物與洗脫后MIP結(jié)構(gòu)組分相同，而兩者的紅外光譜圖其主要特征峰基本保持一致。

3.3 MIP吸附性能評價(jià)

3.3.1 動力學(xué)吸附 動力學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MIP的吸附在5 h后已逐漸趨向平衡，共吸附74.1μmol·g-1，其中，5min可達(dá)到平衡吸附量的15.3%（11.31μmol·g-1），15 min可達(dá)到平衡吸附量的39.6%（29.34μmol·g-1）。

3.3.2 選擇性吸附 聚合物對底物的結(jié)合分配系數(shù)科描述為Kd=CP/CS，式中CP（μmol/g）為底物在聚合物上的結(jié)合量；CS(mmol·L-1)為平衡吸液中底物的濃度。分離因子α描述為α=Kdi/Kdj，式中Kdi/Kdj分別為模板與結(jié)構(gòu)類似物的結(jié)合分配系數(shù)。Kd值越高，表示聚合物對該底物的結(jié)合量越大；ɑ值越高，表示聚合物對底物的選擇性越好。

硼酸基團(tuán)對1，2-順式二醇比其他醇類選擇性更強(qiáng)。根據(jù)這一理論特點(diǎn)，我們分別選取具有1，3-二醇化合物氯霉素、5-氟尿嘧啶，1，2-鄰二醇基團(tuán)的化合物苯基-1，2-乙二醇和冬凌草甲素作為聚合物的底物，對其選擇性進(jìn)行探討。見表。

表1 聚合物對不同底物的選擇性

聚合物：10mg；底物濃度：2mmol·L-1；底物用量=2mL；吸附溶劑：甲醇-磷酸緩沖液（pH=7.40）(V/V，7∶3)；吸附時(shí)間：24小時(shí)；吸附溫度25℃。

從表可看出，MIP對冬凌草甲素的吸附能力優(yōu)于其他三種底物，表現(xiàn)出較好的選擇性。其中5-氟尿嘧啶空間結(jié)構(gòu)較小，較易進(jìn)入MIP孔穴結(jié)構(gòu)中，Kd值較大。MIP與冬凌草甲素官能團(tuán)互補(bǔ)的功能基團(tuán)，再加上與其立體結(jié)構(gòu)相互補(bǔ)的特定形狀的孔穴，使得MIP對冬凌草甲素顯示出特效的選擇結(jié)合特性。NIP數(shù)據(jù)中顯示，NIP對1-苯基-1，2-乙二醇也有較強(qiáng)的結(jié)合能力，這是由于冬凌草甲素與1-苯基-1，2-乙二醇都具有鄰二醇結(jié)構(gòu)，在NIP表面與4-乙烯基苯硼酸的結(jié)合能力基本相同，但不具有孔穴結(jié)構(gòu)的記憶選擇性。據(jù)此，我們可以推測是模板分子冬凌草甲素的順式鄰二醇基團(tuán)與功能單體4-乙烯基苯硼酸的硼酸基團(tuán)相互作用，并最終在聚合物的孔穴中產(chǎn)生了識別位點(diǎn)。

4.結(jié)論

本研究第一次以4-乙烯基苯基硼酸作為功能性單體，二乙烯基苯作為交聯(lián)劑制備出冬凌草甲素的共價(jià)分子印跡聚合物。在吸附實(shí)驗(yàn)中采用可逆共價(jià)特異性結(jié)合的冬凌草甲素分子印跡聚合物不僅顯示出較快的吸附動力學(xué)速率和專一識別性能，且較利用分子間氫鍵結(jié)合的印跡聚合物[3]有更高的吸附量。這項(xiàng)研究也為具有順式二醇結(jié)構(gòu)的中藥活性成分分離純化提供了重要參考。