祁白術(shù)多酚提取工藝及抗氧化、抑菌活性研究

胡長玉 戴 毅 王雅群 盧瑋瑋 王衛(wèi)東 吳永祥,2

(1. 黃山學(xué)院生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，安徽 黃山 245041；2. 安東國立大學(xué)食品科學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，韓國 安東 760749；3. 黃山峰源生物科技有限公司，安徽 黃山 245600)

祁白術(shù)是特產(chǎn)于中國安徽祁門山區(qū)野生白術(shù)(AtractylodesmacrocephalaKoidz.)的干燥根莖，在安徽民間一直被視為珍貴補(bǔ)品，為安徽著名道地藥材[1]。鄭麗[2]對白術(shù)的種質(zhì)資源遺傳多樣性進(jìn)行了深入研究，表明祁白術(shù)擁有豐富的遺傳多樣性，在cpDNA和核基因水平上，都展現(xiàn)出特殊的群體結(jié)構(gòu)。李云志等[3-4]對祁白術(shù)的化學(xué)成分進(jìn)行了分離鑒定，揭示了野生祁白術(shù)與栽培白術(shù)具有不同的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。祁白術(shù)含有揮發(fā)油、內(nèi)酯類物質(zhì)、多糖、多酚等生物活性物質(zhì)[5-7]，具有抗氧化、抑菌、降血糖和降血脂等功效[8-9]。祁白術(shù)道地性及優(yōu)良品質(zhì)的形成與當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)大環(huán)境、群落微環(huán)境及遺傳因子密切關(guān)系[10-11]。本課題組前期[8]研究了祁白術(shù)不同極性萃取物的多酚、黃酮含量及抗氧化、抑菌活性，采用GC-MS分析了其主要化學(xué)成分，表明多酚是祁白術(shù)的主要活性成分，是其發(fā)揮抗氧化、抑菌作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

目前國內(nèi)外學(xué)者[12-13]對白術(shù)化學(xué)成分及功效的研究都是基于栽培白術(shù)，祁白術(shù)多酚提取工藝優(yōu)化的研究尚未見報道，對祁白術(shù)多酚的抗氧化、抑菌作用的研究仍然缺乏。本試驗擬以祁白術(shù)為原料，采用表面活性劑SDS協(xié)同超聲波提取祁白術(shù)多酚，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面優(yōu)選提取工藝條件，同時研究祁白術(shù)多酚的抗氧化、抑菌活性，旨在為祁白術(shù)多酚的綜合開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

祁白術(shù)：采自安徽省祁門縣古溪鄉(xiāng)，采樣時間為2017年8月，由黃山學(xué)院植物學(xué)專家方建新老師鑒定為野生祁白術(shù)(AtractylodesmacrocephalaKoidz.)的干燥根莖；

金黃色葡萄球菌 (Staphylococcusaureus)、枯草芽孢桿菌 (Bacillussubtilis)、大腸桿菌 (Escherichiacoli)、綠膿桿菌 (Pseudomonasaeruginosa)：中國典型培養(yǎng)物菌種保藏中心(CCTCC)；

Folin-Ciocalteu試劑、丁基羥基茴香醚 (butyl hydroxy anisd, BHA)、丹寧酸、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、對羥基苯甲酸丙酯(propylparaben，PP)、2,2-聯(lián)氮-二 (3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸) 二銨鹽(ABTS)、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfonate, SDS)：分析純，美國Sigma-Aldrich公司；

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：生物試劑，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

全波長酶標(biāo)儀：SpectraMax-190型，美國Molecular Devices公司；

超凈工作臺：ZHJH-C2109B型，上海智城分析儀器制造有限公司；

轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：EV341型，北京萊伯泰科儀器有限公司；

數(shù)控加熱功率可調(diào)型超聲波清洗器：SCQ-5201C型，上海聲彥超聲波儀器有限公司；

高壓滅菌器：SQ510C型，重慶雅馬拓科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 祁白術(shù)多酚的提取 將新鮮祁白術(shù)洗凈晾干，于60 ℃ 烘干至恒重，粉碎成粉末，過80目篩。取祁白術(shù)粉末3.0 g，按照設(shè)計安排選取相應(yīng)的SDS質(zhì)量分?jǐn)?shù)、超聲功率、超聲溫度、超聲時間、乙醇濃度、料液比進(jìn)行提取。抽濾后經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，得到祁白術(shù)多酚提取物。

1.2.2 多酚含量測定 采用Folin-Ciocalteu法[14]。以吸光值Y為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品單寧酸(tannic acid, TA)濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=0.001 4X+0.005 3(R2=0.996)。根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)曲線計算不同提取條件下祁白術(shù)多酚含量，結(jié)果以每克祁白術(shù)提取物中含有相當(dāng)單寧酸毫克數(shù)表示，即 mg TA/g。

1.2.3 單因素試驗

(1) SDS質(zhì)量分?jǐn)?shù)：固定超聲功率180 W，超聲溫度60 ℃，超聲時間10 min，乙醇濃度60%，料液比1∶20 (g/mL)，考查SDS質(zhì)量分?jǐn)?shù)(0.0%，0.2%，0.4%，0.6%，0.8%，1.0%)對多酚提取量的影響。

(2) 超聲功率：固定SDS質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.6%，超聲溫度60 ℃，超聲時間10 min，乙醇濃度60%，料液比1∶20 (g/mL)，考查超聲功率(120，150，180，210，240 W)對多酚提取量的影響。

(3) 超聲溫度：固定SDS質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.6%，超聲功率180 W，超聲時間10 min，乙醇濃度60%，料液比1∶20 (g/mL)，考查超聲溫度(40，50，60，70，80 ℃)對多酚提取量的影響。

(4) 超聲時間：固定SDS質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.6%，超聲功率180 W，超聲溫度60 ℃，乙醇濃度60%，料液比1∶20 (g/mL)，考查超聲時間(5，10，15，20，25 min)對多酚提取量的影響。

(5) 乙醇濃度：固定SDS質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.6%，超聲功率180 W，超聲溫度60 ℃，超聲時間10 min，料液比1∶20 (g/mL)，考查乙醇濃度(40%，50%，60%，70%，80%)對多酚提取量的影響。

(6) 料液比：固定SDS質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.6%，超聲功率180 W，超聲溫度60 ℃，超聲時間10 min，乙醇濃度60%，考查料液比[1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30 (g/mL)]對多酚提取量的影響。

1.2.4 響應(yīng)面試驗設(shè)計 采用Box-Behnken設(shè)計原理，根據(jù)單因素試驗的結(jié)果設(shè)計響應(yīng)面試驗，以祁白術(shù)多酚提取量為響應(yīng)值，以SDS質(zhì)量分?jǐn)?shù)、超聲功率、超聲溫度和乙醇濃度為試驗因子，建立響應(yīng)面優(yōu)化方案，進(jìn)行二次多項回歸方程擬合及其優(yōu)化分析。

1.2.5 抗氧化活性的測定

(1) DPPH自由基清除能力：參考文獻(xiàn)[15]，以BHA為陽性對照。

(2) ABTS自由基清除能力：參考文獻(xiàn)[16]，以BHA為陽性對照。

1.2.6 抑菌活性的測定

(1) 菌種活化與菌懸液制備：將4種供試菌接種到試管營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面進(jìn)行活化，活化傳代2次后，在無菌操作臺內(nèi)各挑取已活化好的菌種置于無菌生理鹽水中，配置各菌懸液濃度約為106～107CFU/mL。

(2) 祁白術(shù)多酚的抑菌活性：根據(jù)文獻(xiàn)[17]修改如下：吸取100 μL供試菌懸液均勻涂布各平板上，用移液槍于無菌直徑6 mm的濾紙片中央加入10 μL祁白術(shù)多酚提取物，以對羥基苯甲酸丙酯 (PP) 為陽性對照，以二甲基亞砜(DMSO)為空白對照組，37 ℃倒置培養(yǎng)24 h后測量抑菌圈直徑，結(jié)果重復(fù)3次，取平均值。

(3) 最小抑菌濃度的測定：用DMSO溶劑溶解祁白術(shù)多酚，配制成0.25，0.50，0.75，1.00 mg/mL的樣品溶液，然后參照文獻(xiàn)[18]的方法，觀察各平板抑菌圈的有無，首次出現(xiàn)抑菌圈所對應(yīng)的濃度即為祁白術(shù)多酚的MIC。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SigmaPlot 10.0軟件處理單因素數(shù)據(jù)和作圖。采用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析。采用SPSS 18.0統(tǒng)計分析軟件，利用單因素方差分析(One-way ANOVA)中的Duncan’s多重比較法進(jìn)行差異比較(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 祁白術(shù)多酚提取的單因素試驗

2.1.1 SDS質(zhì)量分?jǐn)?shù)對祁白術(shù)多酚提取量的影響 如圖1 所示，祁白術(shù)多酚提取量隨著SDS質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加呈先增加后下降趨勢。與未添加SDS組 [ (20.90±0.95) mg/g ]相比，當(dāng)SDS添加量為0.4%時祁白術(shù)多酚提取量達(dá)到最大值，為(27.55±0.82)mg/g，多酚提取率提高了31.34%，存在著顯著性差異(P<0.05)。表明表面活性劑SDS的添加，增加了溶液中膠束數(shù)量，從而增強(qiáng)了溶解作用，有利于多酚類物質(zhì)的溶出，但當(dāng)SDS添加量達(dá)到臨界膠束濃度后，形成的膠束數(shù)量不再增加，多酚提取量亦不再增加[19-20]。因此，選取SDS質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%～0.6%作為響應(yīng)面考察條件。

不同字母表示差異顯著 (P<0.05)圖1 SDS質(zhì)量分?jǐn)?shù)對多酚提取量的影響Figure 1 Effect of SDS concentration on the extraction efficiency of polyphenols

2.1.2 超聲功率對祁白術(shù)多酚提取量的影響 如圖2所示，祁白術(shù)多酚提取量隨著超聲波功率的增加呈先增加后下降趨勢。當(dāng)超聲功率為150 W時，多酚提取量達(dá)到最大值，為(28.80±1.04) mg/g。表明超聲波可以破壞植物細(xì)胞壁，增加細(xì)胞膜通透性，利于胞內(nèi)多酚物質(zhì)的溶出，但功率過大可能會導(dǎo)致某些多酚物質(zhì)結(jié)構(gòu)被破壞，從而提取量下降[21]。因此，選取超聲功率120～180 W作為響應(yīng)面考察條件。

不同字母表示差異顯著 (P<0.05)圖2 超聲功率對多酚提取量的影響Figure 2 Effect of ultrasonic power on the extraction efficiency of polyphenols

2.1.3 超聲溫度對祁白術(shù)多酚提取量的影響 如圖3所示，隨著溫度的升高，祁白術(shù)多酚提取量增大，在溫度50 ℃ 時，多酚的提取量達(dá)到最大，為(30.75±1.39) mg/g。當(dāng)超聲溫度繼續(xù)升高，祁白術(shù)多酚提取量轉(zhuǎn)而下降。這與多酚類物質(zhì)的熱穩(wěn)定性有關(guān)，以及當(dāng)溫度接近乙醇沸點(diǎn)時，溶劑揮發(fā)加快，浸出過程難以穩(wěn)定，從而造成提取量降低[22]。因此，選取超聲溫度40～60 ℃作為響應(yīng)面考察條件。

2.1.4 超聲時間對祁白術(shù)多酚提取量的影響 如圖4所示，在5～15 min時，祁白術(shù)多酚提取量隨著超聲時間的延長逐步提高。當(dāng)超聲時間為15 min時，多酚提取量達(dá)到最大值，為(28.14±0.79) mg/g。隨著超聲時間繼續(xù)延長，祁白術(shù)多酚由于長時間受熱及超聲波處理導(dǎo)致多酚類物質(zhì)被氧化而被破壞是其提取量下降的主要原因。因此，選取15 min作為后續(xù)試驗的最佳提取時間。

不同字母表示差異顯著 (P<0.05)圖3 超聲溫度對多酚提取量的影響

Figure 3 Effect of ultrasonic temperature extraction time on the extraction efficiency of polyphenols

不同字母表示差異顯著 (P<0.05)圖4 超聲時間對多酚提取量的影響Figure 4 Effect of ultrasonic extraction time on the extraction efficiency of polyphenols

2.1.5 乙醇濃度對祁白術(shù)多酚提取量的影響 如圖5所示，乙醇濃度為40%～80%時，祁白術(shù)多酚提取量隨著乙醇濃度的增加先增加后下降，在60%時多酚提取量達(dá)到最大值，為(29.44±0.93) mg/g。增大乙醇濃度可以降低溶劑體系的極性，使得溶劑更容易破壞祁白術(shù)多酚類物質(zhì)與多糖、蛋白質(zhì)等物質(zhì)的氫鍵，利于胞內(nèi)多酚物質(zhì)的溶出，但當(dāng)乙醇濃度較高時，脂溶性物質(zhì)、糖類及黏性物質(zhì)等大量滲出，影響多酚類物質(zhì)的提取，同時破壞多酚的穩(wěn)定性，導(dǎo)致多酚提取量下降。因此，選取乙醇濃度50%～70%作為響應(yīng)面考察條件。

2.1.6 料液比對祁白術(shù)多酚提取量的影響 如圖6所示，料液比在1∶10～1∶25 (g/mL)時，祁白術(shù)多酚提取量隨著溶劑添加量的增加而增加，當(dāng)料液比在1∶25～1∶30 (g/mL)時，多酚提取量變化不明顯?？赡苁橇弦罕仍?∶25 (g/mL)時，溶劑對祁白術(shù)多酚類物質(zhì)溶解已達(dá)到平衡，增加溶劑量對增加多酚的提取量幾乎無影響。因此，選取料液比為1∶25 (g/mL)作為后續(xù)試驗。

不同字母表示差異顯著 (P<0.05)圖5 乙醇濃度對多酚提取量的影響Figure 5 Effect of ethanol concentration on the extraction efficiency of polyphenols

不同字母表示差異顯著 (P<0.05)圖6 料液比對多酚提取量的影響Figure 6 Effect of solid-liquid ration on the extraction efficiency of polyphenols

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果與分析

2.2.1 回歸模型的建立 因素水平及編碼見表1。固定超聲時間為15 min，料液比為1∶25 (g/mL)，以SDS質(zhì)量分?jǐn)?shù)、超聲功率、超聲溫度和乙醇濃度為試驗因子，祁白術(shù)多酚提取量為響應(yīng)值，設(shè)計四因素三水平Box-Behnken試驗，試驗結(jié)果見表2。表2的數(shù)據(jù)用Design-Expert V8.0.6分析可得回歸方程：

Y=36.94+2.13A+1.07B-1.31C+1.14D+0.68AB-0.27AC+0.21AD+0.14BC+0.24BD-0.36CD-3.50A2-3.43B2-3.99C2-1.51D2。

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表1 Box-Behnken試驗設(shè)計Table 1 Experimental design of Box-Behnken

表2 響應(yīng)面試驗結(jié)果Table 2 The results of response surface methodology

從表3還可以得到各因素對祁白術(shù)多酚提取量影響的順序為SDS質(zhì)量分?jǐn)?shù)(A)>超聲溫度(C)>乙醇濃度(D)>超聲功率(B)，其中A和B因素對祁白術(shù)多酚提取量的影響極顯著，各因素交互作用影響不顯著(P>0.05)，A2、B2、C2對多酚提取量影響極顯著(P<0.000 1)，D2對多酚提取量影響顯著(P<0.05)。剔除不顯著交互項，得到祁白術(shù)多酚提取量對各自變量的標(biāo)準(zhǔn)回歸方程為：

Y=36.94+2.13A+1.07B-1.31C+1.14D-3.50A2-3.43B2-3.99C2-1.51D2。

(2)

表3 回歸模型方差分析?Table 3 Analysis of variance (ANOVA) regression model

? * 表示差異顯著(P<0.05)；**表示差異極顯著(P< 0.01)。

將表3中數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面曲線分析，二者呈較好的二次拋物線關(guān)系，祁白術(shù)多酚提取量存在最大值。

2.2.3 最佳工藝提取條件的確定及驗證實驗 根據(jù)二次線性回歸方程的分析結(jié)果，祁白術(shù)多酚提取的最優(yōu)條件為：SDS添加量0.47%、超聲功率156.02 W、超聲溫度48.08 ℃、乙醇濃度64.39%，多酚提取量為37.79 mg/g。在實際生產(chǎn)中，考慮到可操作性，確定祁白術(shù)多酚的提取的最優(yōu)工藝為：SDS添加量0.47%，超聲波功率150 W，超聲溫度48 ℃，乙醇濃度64%。采用上述條件，進(jìn)行驗證實驗(n=3)，祁白術(shù)多酚提取量為(38.53±0.51) mg/g，與理論預(yù)測值37.79 mg/g 的相對誤差為1.92%，說明回歸模型與實際情況擬合良好。

2.3 祁白術(shù)多酚的抗氧化活性

2.3.1 對DPPH自由基的清除作用 由圖7可知，祁白術(shù)多酚對DPPH自由基的清除作用呈明顯的劑量效應(yīng)，即隨著多酚濃度的增加，DPPH自由基清除作用隨之增強(qiáng)。當(dāng)祁白術(shù)多酚濃度為0.2 mg/mL時，對DPPH自由基的清除率為94.37%。祁白術(shù)多酚和陽性對照BHA對DPPH自由基清除作用的IC50值分別為0.056，0.015 mg/mL，表明祁白術(shù)多酚具有顯著的DPPH自由基清除能力。

圖7 祁白術(shù)多酚對DPPH自由基的清除作用Figure 7 DPPH free radical scavenging ability of QBP

2.3.2 對ABTS自由基的清除作用 由圖8可知，在0.01～0.20 mg/mL時，祁白術(shù)多酚和BHA對ABTS自由基清除作用隨著濃度的增大先逐漸增強(qiáng)后趨向穩(wěn)定。當(dāng)QBP濃度為0.2 mg/mL時，對ABTS自由基的清除率為88.39%。祁白術(shù)多酚和陽性對照BHA對ABTS自由基的清除作用的IC50值分別為0.05，0.02 mg/mL。以上結(jié)果顯示，祁白術(shù)多酚對DPPH和ABTS自由基清除作用的變化規(guī)律具有較好的一致性，說明多酚類物質(zhì)是祁白術(shù)主要的抗氧化活性成分。

2.4 祁白術(shù)多酚的抑菌活性

由表4可知，祁白術(shù)多酚對4種供試菌均有顯著的抑制作用。當(dāng)祁白術(shù)多酚質(zhì)量濃度為1 mg/mL時，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和綠膿桿菌的最大抑菌圈直徑分別為(11.17±0.22)，(11.83±0.56)，(10.33±0.22)，(11.33±0.22) mm；陽性對照對羥基苯甲酸丙酯(PP)質(zhì)量濃度為1 mg/mL時，對上述4種菌的最大抑菌圈直徑分別為(11.67±0.56)，(11.33±0.22)，(12.17±0.44)，(12.17±0.22) mm。本試驗進(jìn)一步測定了祁白術(shù)多酚對4種供試菌的最低抑菌濃度(MIC)。由表4可知，在0.25～1.00 mg/mL時，QBP對4種供試菌的抑制作用呈現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng)，即隨著多酚濃度的增加，抑菌作用隨之增強(qiáng)。祁白術(shù)多酚對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌的MIC為0.25 mg/mL，對枯草芽孢桿菌的MIC為0.50 mg/mL。結(jié)果表明，祁白術(shù)對4種供試的革蘭氏陽性細(xì)菌和革蘭氏陰性細(xì)菌都有顯著的抑制作用，而多酚類物質(zhì)是其主要的抑菌活性成分。

圖8 祁白術(shù)多酚對ABTS自由基的清除作用Figure 8 ABTS free radical scavenging ability of QBP

表4 祁白術(shù)多酚對4種菌的抑菌圈直徑?Table 4 Diameter of inhibitory zone of the QBP against four common bacterial strains

? 同列不同字母表示在統(tǒng)計學(xué)上具有顯著差異 (P<0.05)。

3 結(jié)論

祁白術(shù)多酚最佳提取工藝為：SDS添加量0.47%，超聲波功率150 W，超聲溫度48 ℃，乙醇濃度64%，超聲時間15 min，料液比1∶25 (g/mL)。在此條件下預(yù)測祁白術(shù)多酚提取量為37.79 mg/g，而經(jīng)驗證實驗得到的實際值為(38.53±0.51) mg/g，預(yù)測值與實際值的吻合率為98.08%，說明回歸模型與實際情況擬合良好，優(yōu)化后的祁白術(shù)多酚提取工藝條件合理可行。本研究揭示了道地藥材祁白術(shù)具有顯著的抗氧化和抑菌活性，明確了多酚類物質(zhì)是其發(fā)揮抗氧化、抑菌作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。下一步將對祁白術(shù)多酚做進(jìn)一步的分離純化，以鑒定出祁白術(shù)多酚抗氧化、抑菌的主要活性化合物。