米糠多糖通過(guò)MAPK通路抑制DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎癥

劉 晶 郭 婷 郭天一,3 鄒佳文,3 周瀟恬,3 何 潔 石雨虹 羅非君,3

(1. 湘南學(xué)院化學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，湖南 郴州 423000；2. 中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院糧油深加工與品質(zhì)控制湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410004；3. 中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院稻谷及副產(chǎn)物深加工國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410004)

中國(guó)是世界上重要的水稻種植大國(guó)之一，其中稻米加工的副產(chǎn)物米糠年產(chǎn)生量超過(guò)1.100×107t。米糠中含有優(yōu)質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、生育酚、纖維素、多糖和谷維素等[1-2]。但目前中國(guó)對(duì)米糠資源的深加工研究不足，僅用于飼料加工，不利于資源的有效利用。

近年來(lái)，米糠中的多糖引起眾多學(xué)者的研究與關(guān)注。米糠多糖(rice bran polysaccharide，RBP)是從稻糠中提取純化后的一種多糖，結(jié)構(gòu)主要為α-1, 6糖苷鍵[3]。與Ito等[4]曾報(bào)道的米糠中提取α活性多糖有相似結(jié)構(gòu)。已有藥理及臨床研究表明，處于初級(jí)研究與開(kāi)發(fā)階段的米糠多糖和研究較為深入的香菇及云芝等中的多糖有類(lèi)似的生物學(xué)作用，如抗腫瘤[5-7]、抗炎[8]、抗氧化[9-10]、提高機(jī)體免疫功能[11-12]、降血脂[13]、降血糖[14]等。

炎癥是機(jī)體對(duì)外界病毒、化學(xué)物質(zhì)等入侵而引發(fā)的自發(fā)反應(yīng)，但過(guò)度炎癥會(huì)造成機(jī)體組織的損傷。潰瘍性結(jié)腸炎是較為常見(jiàn)的慢性炎癥疾病，采用的藥物治療很難斷根，反復(fù)發(fā)作，因此，從天然產(chǎn)物中尋找無(wú)毒副作用的天然產(chǎn)物是重要的防治策略。植物多糖具有多種生物學(xué)功能，已有的研究[15-17]發(fā)現(xiàn)多種植物多糖具有抗炎功能。米糠多糖是否具有抗炎功能，目前尚無(wú)報(bào)道。DSS能造成小鼠結(jié)腸上皮的損傷，內(nèi)毒素入血，結(jié)腸水腫和過(guò)度炎癥。DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎癥模型與臨床潰瘍性結(jié)腸炎病癥類(lèi)似，是最常見(jiàn)的結(jié)腸炎癥模型。本研究使用DSS誘導(dǎo)ICR小鼠，建立結(jié)腸炎癥動(dòng)物模型，評(píng)估米糠多糖的抗炎活性以及研究其分子機(jī)理，將為包含米糠多糖功能性食品的研究與開(kāi)發(fā)提供基礎(chǔ)的理論數(shù)據(jù)及科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

小鼠：采用ICR小鼠，約8周齡，數(shù)量為60只，隨機(jī)分為3組，每組雌雄各半，體重范圍為30.0～34.5 g，湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司；小鼠置湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心飼養(yǎng)，環(huán)境溫度為(22±2) ℃，相對(duì)濕度為40%～70%。動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(湘)-2014-0112。飼養(yǎng)1周后，開(kāi)始試驗(yàn)。小鼠試驗(yàn)期間，每天檢查動(dòng)物房的飼養(yǎng)環(huán)境(包括溫度、濕度、飲用水、飼料等)，確保小鼠生長(zhǎng)在相對(duì)穩(wěn)定的良好環(huán)境。

1.2 材料與試劑

米糠多糖：西安天瑞生物技術(shù)有限公司(經(jīng)本課題組進(jìn)一步純化，多糖含量為90%，可分成兩種不同分子量，一種為500 ku，約占85%，另一種分子量為25 ku，約占15%。米糠多糖中含有甘露糖、葡萄糖、木糖和阿拉伯糖四種單糖，且摩爾比為：1.35∶3.32∶1.00∶1.25，結(jié)構(gòu)為雜單糖，單糖間主要由α-型糖苷鍵連接而成)；

DSS：純度99%，分子量36～50 ku，美國(guó)Pharmacia 公司；

總RNA提取試劑盒、RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、標(biāo)記熒光的RT-qPCR試劑盒：北京全式金生物技術(shù)有限公司；

總蛋白質(zhì)提取試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒：上海碧云天生物技術(shù)有限責(zé)任公司；

抗白細(xì)胞介素-1(interleukin-1β，IL-1β)兔抗(Cat#12507S)、抗誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)兔抗(Cat#13120)、抗腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α，TNFα)兔抗(Cat#6945S)、環(huán)氧化合酶-2(cyclooxygenase-2, Cox-2)兔抗(Cat#12282)、β-Actin鼠抗(Cat#12620)、p44/42 MAPK(ERK1/2) 兔抗(Cat#9194)、phosphor-p44/42 MAPK (p-ERK1/2) 兔抗(Cat#4370)、p38 MAPK兔抗(Cat#9213)、phosphor-p38 MAPK (p-p38) 兔抗(Cat#4511)、JNK MAPK兔抗(Cat#9253)、phosphor-JNK MAPK (p-JNK) 兔抗(Cat#4668)：美國(guó)Cell Signaling Technology 公司；

無(wú)水乙醇、甲醇、氯仿、二甲苯、異丙醇等：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

超純水系統(tǒng)：ZWM-UT1-10型，湖南中沃水務(wù)環(huán)保科技有限公司；

精密分析天平：AUY220型，日本島津公司；

移液槍?zhuān)篜1000-1型，百得實(shí)驗(yàn)室儀器(蘇州)有限公司；

低溫臺(tái)式離心機(jī)：22331 Hambrug型，德國(guó)Eppendorf公司；

-86 ℃超低溫冰箱：DW-HL388型，中科美菱科技有限責(zé)任公司；

光學(xué)顯微鏡：XDS-10型，上海團(tuán)結(jié)儀器制造有限公司；

垂直電泳槽：Mini-PROTEAN Tetra System型，美國(guó)Bio-Rad公司；

電泳儀：PowerPacTMBasic型，美國(guó)Bio-Rad公司；

熒光定量PCR儀：CFX96TMReal-Time System型，美國(guó)Bio-Rad公司；

凝膠成像儀：ChemiDocTMXRS+型，美國(guó)Bio-Rad公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 米糠多糖的配制

(1) 小鼠米糠多糖灌胃溶液：稱(chēng)取米糠多糖400 mg，置于裝有20 mL滅菌超純水的離心管中，蓋緊管蓋后上下顛倒，使米糠多糖粉末充分溶解并混勻，4 ℃保存。

(2) 米糠多糖細(xì)胞溶液：精確稱(chēng)取米糠多糖100 mg，溶于10 mL滅菌超純水中，充分震蕩混勻后配制成10 mg/mL 米糠多糖工作液，使用0.45 μm微孔濾膜進(jìn)行除菌過(guò)濾，分裝于1.0 mL EP管中，整個(gè)配制過(guò)程需在無(wú)菌環(huán)境下進(jìn)行。

1.4.2 試驗(yàn)小鼠的分組 小鼠進(jìn)行1周喂養(yǎng)后，30只ICR雄性小鼠，隨機(jī)分成3組，30只ICR雌性小鼠也隨機(jī)分成3組，再隨機(jī)組合，每組雌雄各半，設(shè)為正常對(duì)照、DSS損傷、米糠多糖保護(hù)3組。對(duì)照組試驗(yàn)小鼠自由攝食和飲水，損傷組試驗(yàn)小鼠自由飲食2 d，從第3天開(kāi)始飲用3.0% DSS溶液；保護(hù)組小鼠第1天起到試驗(yàn)結(jié)束灌胃米糠多糖溶液[劑量為500 mg/(kg·d)]，第3天起到試驗(yàn)結(jié)束飲用3.0% DSS溶液和自由攝食。小鼠試驗(yàn)結(jié)束后，將試驗(yàn)小鼠頸椎脫臼處死，先摘小鼠眼球，取血液樣本，然后解剖小鼠取出結(jié)腸、脾臟等器官組織，快速置低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 疾病活動(dòng)指數(shù)(disease activity index, DAI)評(píng)分

每只小鼠從試驗(yàn)開(kāi)始至結(jié)束期間，每天早上8:30測(cè)定體重、飲水量和攝食量，并仔細(xì)觀察小鼠的精神狀態(tài)、大便形狀以及便血程度。按照表1的DAI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，由同一個(gè)試驗(yàn)員對(duì)各試驗(yàn)小鼠進(jìn)行DAI(DAI=便血分?jǐn)?shù)+體重下降分?jǐn)?shù)+大便性狀分?jǐn)?shù))[18]評(píng)分。試驗(yàn)小鼠糞便隱血測(cè)定：將少量的小鼠糞便用棉簽比較均勻地涂抹在載玻片上，分別滴加3～5滴鄰聯(lián)甲苯胺溶液和3.0% H2O2溶液，仔細(xì)觀察小鼠糞便的顏色，判斷小鼠糞便的隱血程度：① 隱血呈陰性：2 min內(nèi)幾乎無(wú)變化；② 隱血呈弱陽(yáng)性：10 s左右由淺(藍(lán))逐漸變深；③ 隱血呈陽(yáng)性：由淺藍(lán)褐色逐漸變?yōu)樗{(lán)褐色；④ 隱血呈強(qiáng)陽(yáng)性：立即顯現(xiàn)為藍(lán)褐色。

表1 DAI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Evaluation standard of DAI scoring

1.4.4 小鼠結(jié)腸組織髓過(guò)氧化物酶活性測(cè)定 髓過(guò)氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)存在于免疫細(xì)胞(中性白細(xì)胞)中，利用其還原過(guò)氧化氫的能力，可以測(cè)定MPO的活性。MPO還原過(guò)氧化氫得到的復(fù)合物，經(jīng)供氫體鄰連茴香胺作用生成黃色化合物，測(cè)定該黃色化合物在460 nm處的吸光度得到其生成量，推算出MPO的活性。小鼠結(jié)腸組織MPO活性的測(cè)定按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，MPO活力單位以每克結(jié)腸組織濕片于37 ℃的反應(yīng)體系中分解1 μmol過(guò)氧化氫為1個(gè)酶活力單位。

1.4.5 小鼠結(jié)腸組織丙二醛(MDA)含量的測(cè)定 根據(jù)Xu等[19]報(bào)道的方法稍做改正。取約90 mg小鼠結(jié)腸組織，在預(yù)冷的PBS溶液中清洗干凈，加入1.0 mL PBS溶液，然后在玻璃勻漿中勻漿，10 000 r/min 離心10 min，取上清，采用BCA法，測(cè)定樣本中總蛋白含量。取組織混懸液加入0.67%硫代巴比士酸和25%三氯乙酸，95 ℃維持45 min。13 000 r/min 離心20 min，取上清液，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)535 nm吸光值，計(jì)算MDA的含量。

1.4.6 結(jié)腸組織亞硝酸鹽含量的測(cè)定 參考Miranda等[20]的報(bào)道稍做改正，具體如下：取60 mg小鼠結(jié)腸組織，加入220 μL PBS中勻漿，取120 μL樣品加入到120 μL 甲醇中，3 500 r/min 離心10 min，取上清液。100 μL 試驗(yàn)樣本，依次加入100 μL三氯化釩、50 μL磺胺和50 μL NEDD，在37 ℃下培養(yǎng)箱中孵育30 min，用酶標(biāo)儀測(cè)定540 nm吸光值，然后計(jì)算結(jié)腸樣本中亞硝酸鹽的含量。

1.4.7 小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)分析 試驗(yàn)完成后，采用頸椎脫臼法，快速處死試驗(yàn)小鼠，然后快速打開(kāi)小鼠腹腔，分離小鼠的整個(gè)結(jié)腸，預(yù)冷的PBS溶液中清洗，取距離肛門(mén)約1 cm的小段結(jié)腸組織，用10%中性福爾馬林溶液，固定24～48 h，然后采用流水沖洗過(guò)夜，不同濃度梯度酒精依次脫水，用二甲苯透明，透蠟，用蘇木精染色液染色5～10 min，流水沖洗10～15 min，再用純水沖洗數(shù)秒，95%乙醇沖洗5 s。置伊紅染色液中染色1～2 min，純水洗2次，95%乙醇脫水2次。二甲苯透明約5 min。采用樹(shù)膠封存，在顯微鏡下觀察結(jié)腸組織病理學(xué)變化。

1.4.8 RT-qPCR測(cè)定結(jié)腸組織炎癥因子mRNA表達(dá)水平 提取RNA營(yíng)造一個(gè)無(wú)RNA酶的環(huán)境，將提取RNA過(guò)程中使用的相關(guān)工具采用0.1%焦碳酸二乙酯(diethy pyrocarbonate，DEPC)溶液避光浸泡24 h，并高壓蒸汽滅菌再烘干處理。每組稱(chēng)取動(dòng)物結(jié)腸組織約100 mg，置于1.5 mL EP管中迅速放入液氮中，再倒入已用液氮預(yù)冷的研缽中研磨成粉。使用Trizol法嚴(yán)格按照Tranzol-up試劑盒說(shuō)明書(shū)操作流程提取RNA。1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性并用超微量分光光度儀測(cè)定RNA濃度和純度。測(cè)定其濃度，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。炎癥因子PCR引物序列參見(jiàn)劉博等[21]報(bào)道。qPCR反應(yīng)條件：94 ℃，3 min；94 ℃，35 s；60 ℃，40 s；72 ℃，1 min；42個(gè)循環(huán)，采用2-ΔΔCt(RQ)法計(jì)算靶基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

1.4.9 Western blotting測(cè)定結(jié)腸組織炎癥因子和MAPK磷酸化蛋白的表達(dá) 每組稱(chēng)取100 mg小鼠結(jié)腸組織，加液氮研磨成粉末，用含蛋白酶抑制劑cocktail的RIPA 裂解液充分裂解后，4 ℃下10 000 r/min離心10 min 后取上層透明液體，即為蛋白。取2 μL蛋白直接采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。隨后按照1∶1 比例加入2×SDS(sodium dodecyl sulfate，十二烷基硫酸鈉)上樣緩沖液，在95 ℃下加熱5 min使蛋白變性。根據(jù)目的基因分子量的大小配制適宜濃度的SDS-PAGE膠(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，聚丙烯酰胺凝膠)，取處理好的樣品進(jìn)行電泳分離，然后將蛋白轉(zhuǎn)到聚偏二氟乙烯膜上。轉(zhuǎn)膜完后，用1×TBST配制的5%牛血清蛋白(BSA)封閉液封閉1 h，再孵育1∶1 000稀釋的一抗，置于脫色搖床上過(guò)夜。第2天取出膜用1×TBST溶液清洗3次，10 min/次；接著孵育1∶5 000稀釋的二抗稀釋液，置于搖床上孵育1 h，之后采用一抗孵育完的清洗方式。最后將膜浸泡于自制顯影液中于凝膠成像儀中成像并采集圖片。目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量為目的條帶(基因)積分光密度值與內(nèi)參照(β-Actin)的積分光密度值的比值。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件將試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(means±SD)表示，試驗(yàn)設(shè)立3個(gè)平行組，組間比較采用方差分析和t檢驗(yàn)，P<0.01有極顯著性差異，P<0.05有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 米糠多糖對(duì)DSS誘導(dǎo)小鼠宏觀表型的影響

正常對(duì)照組小鼠體重、飲食飲水量狀況保持穩(wěn)定增加，動(dòng)作靈活，毛發(fā)有光澤，大便性狀正常，其他方面也均符合正常小鼠的生長(zhǎng)狀況。DSS能造成小鼠結(jié)腸上皮的損傷，內(nèi)毒素入血，結(jié)腸水腫和過(guò)度炎癥。DSS損傷組小鼠慢慢呈現(xiàn)潰瘍性結(jié)腸炎癥癥狀：體重增長(zhǎng)越來(lái)越慢，后期體重呈明顯的下降趨勢(shì)，同時(shí)，攝食量下降、精神狀態(tài)較差、活動(dòng)量減少，不同程度的便稀、便血。相比于DSS損傷組，米糠多糖灌胃組小鼠體重有部分增加，而疾病活動(dòng)指數(shù)也明顯下調(diào)，提示米糠多糖能明顯地改善小鼠的健康狀況，見(jiàn)圖1(a)和(b)。小鼠DSS處理后，小鼠出現(xiàn)嚴(yán)重腹瀉，腹瀉率高達(dá)90%，米糠多糖灌胃組小鼠也有80%出現(xiàn)了腹瀉，但癥狀相對(duì)較輕，見(jiàn)圖1(c)。同時(shí)，通過(guò)隱血試驗(yàn)分析，DSS也導(dǎo)致90%小鼠出現(xiàn)便血，米糠多糖灌胃組小鼠則降為70%(P<0.05)，說(shuō)明米糠多糖能部分改善小鼠的便血癥狀，見(jiàn)圖1(d)。本研究發(fā)現(xiàn)米糠多糖能明顯改善小鼠的健康狀況，說(shuō)明米糠多糖可能是一種潛在防治潰瘍性結(jié)腸炎的功能活性成分。

2.2 米糠多糖對(duì)DSS 誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸、脾臟的影響

小鼠飲用DSS能產(chǎn)生結(jié)腸炎癥典型特征，如試驗(yàn)小鼠結(jié)腸呈現(xiàn)水腫、充血、形成潰瘍、小鼠結(jié)腸的腸壁明顯增厚、結(jié)腸的重量顯著增重和長(zhǎng)度呈現(xiàn)縮短等，見(jiàn)圖2(a)。米糠多糖灌胃小鼠，結(jié)腸長(zhǎng)度明顯增加，見(jiàn)圖2(b)。脾臟是重要的免疫器官，是機(jī)體的細(xì)胞免疫以及體液免疫的中心，脾臟組織中含有大量的淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。DSS也能促使小鼠脾臟水腫，形成炎癥，脾臟體積增大和重量增加，見(jiàn)圖2(c)和(d)。米糠多糖灌胃小鼠也能部分抑制小鼠脾臟的水腫和炎癥，脾臟體積和重量顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)圖2(c)和(d)。結(jié)果提示米糠多糖能改善DSS誘導(dǎo)小鼠的結(jié)腸炎癥和脾臟炎癥，可能具有較廣泛的抗炎功效。

*：P<0.05 **：P<001 #：P>0.05圖1 米糠多糖對(duì)小鼠健康狀況的影響Figure 1 Effects of rice bran polysaccharide on health status of mice

*：P<0.05 **：P<001圖2 米糠多糖對(duì)小鼠結(jié)腸和脾臟的影響Figure 2 Effects of rice bran polysaccharide on colon and spleen of mice

2.3 米糠多糖對(duì)DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸組織MPO、MDA和亞硝酸鹽含量的影響

髓過(guò)氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)又叫過(guò)氧化物酶，是由中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌的血紅素蛋白酶。機(jī)體發(fā)生炎癥時(shí)，免疫細(xì)胞被征集到損傷組織，是重要的損傷指標(biāo)之一。DSS誘導(dǎo)促使小鼠結(jié)腸炎癥，結(jié)果發(fā)現(xiàn)結(jié)腸組織MPO含量明顯上升，增加了3.46倍；米糠多糖能部分抑制MPO含量的增加，下調(diào)25.9%，見(jiàn)圖3(a)。丙二醛(malondialdehyde，MDA)是膜脂過(guò)氧化最重要的產(chǎn)物之一，可以通過(guò)測(cè)定MDA的含量來(lái)評(píng)估細(xì)胞膜損傷的程度，是組織重要的損傷指標(biāo)之一。在DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸組織中，MDA的含量顯著增加，增加了3.71倍，米糠多糖能部分抑制MDA含量的增加，下調(diào)33.4%，見(jiàn)圖3(b)。通過(guò)對(duì)小鼠結(jié)腸損傷的評(píng)估，提示米糠多糖能降低DSS誘導(dǎo)結(jié)腸組織的損傷。NO是一種重要的炎癥介質(zhì)，但NO在組織中極不穩(wěn)定，快速形成硝酸鹽和亞硝酸鹽，因此，測(cè)定組織中硝酸鹽和亞硝酸鹽的含量，可間接定量組織中NO釋放量，在DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸組織中，硝酸鹽的含量顯著增加3.54倍，米糠多糖能部分抑制硝酸鹽含量的增加，下調(diào)45.1%，見(jiàn)圖3(c)。試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明米糠多糖也能抑制炎癥介質(zhì)NO的釋放。

*：P<0.05 **：P<001圖3 米糠多糖對(duì)小鼠結(jié)腸組織損傷的影響Figure 3 Effects of rice bran polysaccharide on the damage of colonic tissues in mice

2.4 米糠多糖對(duì)DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸組織病理的影響

由圖4可知，對(duì)照組小鼠結(jié)腸黏膜沒(méi)有損傷，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)結(jié)腸組織；DSS損傷組試驗(yàn)小鼠結(jié)腸組織中上皮細(xì)胞損傷嚴(yán)重，黏膜上皮充血、糜爛，杯狀細(xì)胞明顯減少，腺體隱窩不完全或完全缺失，并且大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)結(jié)腸組織；相比DSS損傷組，米糠多糖灌胃小鼠的結(jié)腸組織損傷明顯減輕，結(jié)腸上皮相對(duì)完好，腺體隱窩排列比較規(guī)則，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)部分減少。結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)米糠多糖能減少DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸組織損傷。

2.5 米糠多糖對(duì)DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸組織炎癥因子表達(dá)的影響

過(guò)度的炎癥反應(yīng)產(chǎn)生大量的炎癥因子，從而對(duì)機(jī)體產(chǎn)生極大的損傷。TNFα在潰瘍性結(jié)腸炎患者血清中TNFα的濃度明顯增高，且與病情呈正相關(guān)。TNFα能促使單核細(xì)胞在炎癥組織局部聚集，同時(shí)也能產(chǎn)生許多炎癥因子或前體炎癥因子如白細(xì)胞介素和一氧化氮等，使炎癥大爆發(fā)，誘導(dǎo)結(jié)腸水腫，使得組織黏膜損傷壞死[22-23]。在DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎中，TNFα被認(rèn)為是一種關(guān)鍵的促進(jìn)炎子。取各組小鼠結(jié)腸組織提取總RNA，熒光實(shí)時(shí)定量PCR分析發(fā)現(xiàn)：正常結(jié)腸組織炎癥因子表達(dá)均很低；相對(duì)于正常小鼠結(jié)腸組織，當(dāng)DSS誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生結(jié)腸炎癥后，結(jié)腸組織TNFαmRNA表達(dá)增加6.81倍，米糠多糖灌胃小鼠結(jié)腸組織TNFαmRNA表達(dá)下調(diào)29.4%[圖5(a)] 。這樣就能中斷TNFα引發(fā)的瀑布效應(yīng)，米糠多糖對(duì)結(jié)腸炎癥組織的保護(hù)作用可能與減少TNFα表達(dá)相關(guān)。如有報(bào)道[24]采用siRNA干預(yù)小鼠結(jié)腸的TNFα表達(dá)量，能部分改善結(jié)腸炎患者的臨床病征。

圖4 米糠多糖對(duì)小鼠結(jié)腸組織損傷的影響 (200×)

Figure 4 Effects of rice bran polysaccharide on the pathological damages of colonic tissues in mice (200×)

*：P<0.05；**：P<001圖5 米糠多糖對(duì)小鼠結(jié)腸組織炎癥因子mRNA表達(dá)的影響Figure 5 Effect of rice bran polysaccharide on the mRNA expressions of inflammatory factors in colonic tissues of mice

炎癥因子IL-1β也是炎癥的主要驅(qū)動(dòng)因子，IL-1β主要由浸潤(rùn)結(jié)腸黏膜的單核細(xì)胞(巨噬細(xì)胞)分泌[25]。IL-1β也能與其他的促炎因子協(xié)同，引發(fā)炎癥反應(yīng)和組織損傷的梯級(jí)炎癥反應(yīng)，從而進(jìn)一步加重炎癥[26]。臨床研究也發(fā)現(xiàn)結(jié)腸炎患者IL-1β明顯升高[27]。本研究發(fā)現(xiàn)相對(duì)于正常小鼠結(jié)腸組織，炎癥因子IL-1βmRNA表達(dá)在DSS損傷組小鼠結(jié)腸組織上升了3.86倍，米糖多糖下調(diào)IL-1βmRNA表達(dá)50.1%[圖5(b)]。與TNFα類(lèi)似，也能中斷IL-1β和其他的細(xì)胞因子協(xié)同引發(fā)的炎癥瀑布效應(yīng)。同時(shí)，米糠多糖也可能與部分改善小鼠的便血相關(guān)，如用紫草萘醌降低小鼠的IL-1β表達(dá)，能促進(jìn)糞便的形成，減少便血[28]。

環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase-2，Cox-2)為一種在正常組織中較少表達(dá)的誘導(dǎo)酶，而當(dāng)細(xì)胞受到炎癥刺激時(shí)大量表達(dá)。由于Cox-2可以快速應(yīng)答一系列促炎介質(zhì)和細(xì)胞因子，因此，長(zhǎng)久以來(lái)一直被認(rèn)為在炎癥發(fā)生的病理過(guò)程中扮演重要角色。Cox-2 mRNA表達(dá)水平在DSS損傷組小鼠結(jié)腸組織上升了5.12倍，米糠多糖下調(diào)Cox-2 mRNA表達(dá)30.1%[圖5(c)]；試驗(yàn)結(jié)果提示米糠多糖能抑制DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸組織炎癥的轉(zhuǎn)錄。

NO也是一種炎癥介質(zhì)，可以直接殺滅入侵的細(xì)菌，在炎癥狀態(tài)下，可以作為炎癥遞質(zhì)起到信號(hào)傳導(dǎo)作用。在機(jī)體處于急性炎癥反應(yīng)的時(shí)候，許多中性粒細(xì)胞和少量巨噬細(xì)胞便會(huì)激活誘生型一氧化氮合酶(iNOS)，誘導(dǎo)精氨酸生出大量的NO，在潰瘍性結(jié)腸炎中主要是iNOS起作用，測(cè)定結(jié)腸組織iNOS、NO 水平可作為反映潰瘍性結(jié)腸炎病變程度和判斷預(yù)后的一個(gè)客觀指標(biāo)[29]。本研究發(fā)現(xiàn)結(jié)腸組織中iNOS有少量的表達(dá)，DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸組織iNOS表達(dá)顯著上升，米糠多糖能明顯抑制iNOS表達(dá)和結(jié)腸組織亞硝酸鹽的形成[圖5(d)]。

通過(guò)Western blotting 進(jìn)一步分析顯示，正常對(duì)照組小鼠結(jié)腸組織中IL-1β和iNOS蛋白表達(dá)極低，TNFα和Cox-2蛋白表達(dá)較低；DSS誘導(dǎo)組小鼠結(jié)腸組織IL-1β蛋白表達(dá)水平增加了5.47倍，米糠多糖灌胃使小鼠結(jié)腸組織IL-1β蛋白表達(dá)水平下降26.5%[圖6(a)]；炎癥因子TNFα在DSS損傷組小鼠結(jié)腸組織中蛋白表達(dá)水平上升3.43倍，米糠多糖灌胃使小鼠結(jié)腸組織IL-1β蛋白表達(dá)水平下降61.8%[圖6(b)]；相對(duì)于正常小鼠結(jié)腸組織，DSS損傷組小鼠結(jié)腸組織Cox-2蛋白表達(dá)水平上升4.85倍，米糠多糖灌胃使小鼠結(jié)腸組織Cox-2蛋白表達(dá)水平下降26.4%[圖6(c)]；iNOS是炎癥因子NO釋放的關(guān)鍵調(diào)控酶，在DSS損傷組小鼠結(jié)腸組織中蛋白表達(dá)水平上調(diào)了9.87倍，米糠多糖灌胃使小鼠結(jié)腸組織iNOS蛋白表達(dá)水平下降達(dá)70.9%[圖6(d)]。小鼠結(jié)腸組織蛋白表達(dá)分析進(jìn)一步證實(shí)了米糠多糖能抑制DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸組織炎癥因子的表達(dá)。

米糠多糖+DSS組與DSS組比較，*：P<0.05；**：P<001圖6 米糠多糖對(duì)小鼠結(jié)腸組織炎癥因子蛋白表達(dá)的影響

Figure 6 Effect of rice bran polysaccharide on the protein expressions of inflammatory factors in colonic tissues of mice

2.6 米糠多糖對(duì)DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸組織MAPK信號(hào)通路的影響

MAPK是機(jī)體最重要的信號(hào)傳導(dǎo)通路，參與多種生物學(xué)功能。MAPK也是炎癥啟動(dòng)和發(fā)展的重要信號(hào)通路，MAPK家族包括ERK1、ERK2、JNK、p38等成員，其均與炎癥的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[30]。為了進(jìn)一步探討米糠多糖抗炎性質(zhì)的機(jī)理，研究了米糠多糖對(duì)重要炎癥信號(hào)通路MAPK的影響。采用非磷酸化ERK1/2、JNK和p38抗體Western blotting分析發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組、DSS損傷組和米糠多糖保護(hù)組小鼠結(jié)腸組織ERK1/2、JNK和p38表達(dá)無(wú)明顯變化，提示DSS誘導(dǎo)并不能調(diào)控此3種蛋白基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，同時(shí)，米糠多糖灌胃也不能改變小鼠結(jié)腸組織ERK1/2、JNK和p38基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。采用磷酸化ERK1/2抗體Western blotting分析發(fā)現(xiàn)，DSS誘導(dǎo)促使小鼠結(jié)腸組織ERK1/2磷酸化蛋白含量增加，上升了2.24倍，米糠多糖灌胃ERK1/2磷酸化蛋白含量下降了30.8%[圖7(a)]；JNK磷酸化蛋白含量在DSS損傷組小鼠結(jié)腸組織中蛋白表達(dá)水平上升2.78倍，米糠多糖灌胃使小鼠結(jié)腸組織JNK磷酸化蛋白含量下降51.4%[圖7(b)]；相對(duì)于ERK1/2和JNK磷酸化蛋白含量，p38磷酸化蛋白含量在正常小鼠結(jié)腸組織中極低，DSS損傷組小鼠結(jié)腸組織p38磷酸化蛋白含量增加了3.35倍，米糠多糖灌胃使小鼠結(jié)腸組織Cox-2蛋白表達(dá)水平下降26.0%[圖7(c)]。ERK1/2、JNK和p38蛋白磷酸化是MAPK的激活狀態(tài)，米糠多糖能抑制結(jié)腸組織ERK1/2、JNK和p38蛋白的磷酸化，說(shuō)明米糠多糖能抑制MAPK信號(hào)通路的活化，參與其抗炎作用。MAPK家族成員能使促轉(zhuǎn)錄因子AP-1(如c-Jun)和NF-κB (p65)的磷酸化，促使轉(zhuǎn)錄因子活化和核移位[31-32]。在炎癥因子IL-1β、TNFα和基因啟動(dòng)子區(qū)域，均存在一個(gè)或多個(gè)AP-1和NF-κB，調(diào)控炎癥因子的表達(dá)[33-35]。本研究發(fā)現(xiàn)米糠多糖能部分抑制DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸組織MAPK活化，提示米糠多糖可能通過(guò)抑制MAPK信號(hào)通路，下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子AP-1和NF-κB的活性，從而抑制炎癥因子表達(dá)。

米糠多糖+DSS組與DSS組比較，*：P<0.05；**： P<001圖7 米糠多糖對(duì)小鼠結(jié)腸組織MAPK信號(hào)通路的影響Figure 7 Effect of rice bran polysaccharide on MAPK signaling pathway in colonic tissues of mice

3 結(jié)論

米糠多糖無(wú)毒副作用且具有抗結(jié)腸炎癥的作用，為防治結(jié)腸炎癥提供了新的思路。本研究發(fā)現(xiàn)米糠多糖可明顯改善DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎癥小鼠健康狀況，減輕DSS導(dǎo)致的小鼠結(jié)腸組織的損傷，下調(diào)結(jié)腸中炎癥因子的表達(dá)，對(duì) DSS 誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎癥具有一定的防治功能，提示添加米糠多糖可能開(kāi)發(fā)相關(guān)輔助藥物和預(yù)防腸炎的功能性食品、保健食品提供科學(xué)理論依據(jù)。

當(dāng)前已證實(shí)有許多食品來(lái)源的多糖具有抗炎作用，但其作用的分子機(jī)理尚不清楚[16]。米糠多糖能抑制MAPK信號(hào)通路，但MAPK通路如何調(diào)控炎癥因子的表達(dá)尚需要進(jìn)一步研究，同時(shí)，米糠多糖如何調(diào)控MAPK通路，也需要進(jìn)一步探索。除此之外，多糖是一類(lèi)結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜的混合物，不同的分子量組分可能呈現(xiàn)相反的生物學(xué)功能[16]，因此，多糖的結(jié)構(gòu)差異、分子量大小與免疫調(diào)節(jié)的關(guān)系還需要采用新的技術(shù)手段來(lái)解決。