德州驢乳清蛋白差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究

張新浩，李海靜，劉景輝，楊 莉，嵇傳良，趙付偉

（國家膠類中藥工程技術(shù)研究中心，東阿阿膠股份有限公司，山東 聊城 252200）

驢奶的營養(yǎng)成分比例與母乳相近，對患牛奶蛋白過敏或食物不耐受的嬰兒致敏性較低［1］。另外，驢奶可促進(jìn)免疫反應(yīng)，預(yù)防代謝疾病［2］，適合作為老年人的營養(yǎng)乳品。由于驢受孕率低、產(chǎn)奶量少，驢奶的市場需求長期得不到解決。驢產(chǎn)奶量受熱應(yīng)激、擠奶工藝、年齡和泌乳階段等因素影響［3］。目前對于驢奶生產(chǎn)的環(huán)境、管理和工藝都有較好的研究基礎(chǔ)，但對影響驢產(chǎn)奶量的分子機(jī)制尚未見報(bào)道。

乳汁分泌受乳腺細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)表達(dá)調(diào)控［4］。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，乳蛋白中不同成分，尤其是低豐度蛋白，也可以被準(zhǔn)確地分析。除基于同位素標(biāo)記的蛋白質(zhì)組學(xué)方法外，無標(biāo)簽質(zhì)譜分析法（MS）是一種快速、可復(fù)制、精確的定量策略，可鑒定顯著差異或無顯著差異的兩組蛋白質(zhì)樣本間的全部表達(dá)蛋白［5］，已被廣泛用于不同奶樣蛋白質(zhì)表達(dá)譜分析和鑒定潛在的生物標(biāo)記蛋白［6］。本試驗(yàn)中，通過無標(biāo)簽質(zhì)譜方法，首次研究了德州驢奶蛋白質(zhì)組學(xué)和影響驢產(chǎn)奶量的分子機(jī)制，為今后開展相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣本收集與處理

根據(jù)產(chǎn)奶記錄，從山東聊城某驢場選擇8頭經(jīng)產(chǎn)德州驢，年齡均5歲且處于泌乳后期。8頭母驢飼喂條件相同，其中4頭為高產(chǎn)母驢（H組），平均單次頭均產(chǎn)奶量 1.04 kg±0.15 kg，4頭為低產(chǎn)母驢（L組），平均單次頭均產(chǎn)奶量0.24 kg±0.06 kg。新鮮奶樣由專人手工采集，于-80℃保存。

樣品解凍、混池后，5 000 r/min離心10 min，去除乳脂層。每個(gè)樣品中加入哺乳動物蛋白酶抑制劑混合物，去除酪蛋白［7］。加入 60 mM CaCl2，調(diào)節(jié) pH 值至 4.3，4℃12 000 r/min離心60 min，收集上清。

1.2 蛋白提取和消化

SDT（4%SDS，100 mM Tris-HCl，1 mM DTT，pH 值7.6）緩沖液用于樣品溶解和蛋白提取。采用BCA蛋白分析試劑盒（Bio-Rad，USA）進(jìn)行蛋白定量，用胰蛋白酶進(jìn)行蛋白消化［8］。消化后多肽經(jīng)C18吸附柱（EmporeTMSPE C18 Cartridges，7 mm bed I.D.，3 mL volume，Sigma）脫鹽，真空離心濃縮，復(fù)溶于40 μL濃度為 0.1%（v/v）甲酸。

1.3 LC-ESI-MS/MS分析

每個(gè)樣品采用HPLC液相系統(tǒng)Easy nLC進(jìn)行分離。緩沖液A液為0.1%甲酸水溶液，B液為0.1%甲酸乙腈水溶液（乙腈為84%）。色譜柱以95%的A液平衡，上樣柱（Thermo Scientific Acclaim PepMap100，100 μm×2 cm，NanoViper C18），經(jīng)過分析柱（Thermo scientific EASY column，10 cm，ID 75 μm，3 μm，C18-A2）分離，流速為300 nL/min。樣品經(jīng)色譜分離后用Q-Exactive質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析。

1.4 差異表達(dá)蛋白質(zhì)（DEPs）的功能性分析

質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析使用MaxQuant和UniProtKB Equus數(shù)據(jù)庫。首先，利用NCBI BLAST將目標(biāo)蛋白質(zhì)集合與適當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對。其次，利用Blast2GO Command Line對目標(biāo)蛋白質(zhì)集合及符合條件的比對序列所關(guān)聯(lián)的GO條目進(jìn)行提取。可以通過InterProScan［5］搜索EBI數(shù)據(jù)庫中與目標(biāo)蛋白質(zhì)匹配的保守基序（Motif），并將Motif相關(guān)的功能信息注釋給目標(biāo)蛋白質(zhì)序列；并運(yùn)行ANNEX對注釋信息進(jìn)一步補(bǔ)充，并在不同的GO類別之間建立聯(lián)系，以提高注釋的準(zhǔn)確性。利用KAAS軟件，將目標(biāo)蛋白質(zhì)序列進(jìn)行KO歸類，并獲取目標(biāo)蛋白質(zhì)序列參與的通路信息。

通過 Fisher精確檢驗(yàn)（Fisher's exact test），比較各個(gè)GO分類或KEGG通路在目標(biāo)蛋白質(zhì)集合和總體蛋白質(zhì)集合中的分布情況，以評價(jià)某個(gè)GO term或KEGG通路蛋白質(zhì)富集度的顯著性水平。使用STRING從IntAct分子相互作用數(shù)據(jù)庫中檢索目標(biāo)蛋白質(zhì)之間的相互作用關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)奶量數(shù)據(jù)分析

測定并記錄每頭母驢6個(gè)月泌乳期內(nèi)的產(chǎn)奶量變化，從分娩后45 d開始，每15天作為1個(gè)泌乳階段，每個(gè)階段保證3次產(chǎn)奶量有效數(shù)據(jù)，H組和L組的泌乳曲線如圖1所示，高產(chǎn)驢產(chǎn)奶量顯著高于低產(chǎn)驢（P＜0.05）。

圖1 高產(chǎn)驢與低產(chǎn)驢的泌乳曲線

2.2 驢乳清蛋白的定量分析

經(jīng)過比對馬屬動物蛋白組數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)了216種乳清蛋白。以倍數(shù)變化大于2.0倍（上調(diào)大于2倍或下調(diào)小于0.5），且P＜0.05的標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達(dá)蛋白質(zhì)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，19個(gè)差異表達(dá)蛋白，高產(chǎn)組 HSP90AB1、HSPA8、HSP90AA1、CSE1L 等 16個(gè)蛋白上調(diào)，TUBA1A、SERPINF2、鈉/核苷協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白3個(gè)蛋白下調(diào)。H組和L組差異表達(dá)蛋白如表1所示。

2.3 DEPs分析

GO富集分析的3個(gè)功能集，細(xì)胞組分、分子功能和參與的生物過程均采用Fisher精確檢驗(yàn)，顯著性水平P＜0.05。在分子功能方面，相對比L組蛋白質(zhì)，H組蛋白質(zhì)與結(jié)合、催化活性、分子功能調(diào)節(jié)、結(jié)構(gòu)分子活性和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性有關(guān)，詳見表2。在生物過程的范疇中，具有不同豐度的蛋白質(zhì)主要涉及細(xì)胞過程、代謝過程和生物過程調(diào)節(jié)。

在Fisher精確檢驗(yàn)的基礎(chǔ)上應(yīng)用KEGG途徑富集分析，將整個(gè)定量蛋白質(zhì)作為背景數(shù)據(jù)集。差異顯著性水平為P＜0.05。H組差異表達(dá)蛋白主要參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白合成、雌激素信號通路、Th17細(xì)胞分化、孕酮介導(dǎo)卵 母細(xì)胞成熟和PI3K-Akt信號通路，詳見表3。

表1 H組和L組差異表達(dá)蛋白統(tǒng)計(jì)

表2 差異蛋白質(zhì)GO富集分析

表3 差異蛋白質(zhì)的KEGG通路富集分析

3 討論

在奶牛及綿羊的產(chǎn)奶量差異方面，已有通過組學(xué)方法比較基因或蛋白質(zhì)表達(dá)譜的研究，并鑒定候選分子生物標(biāo)志物［9-10］。然而，關(guān)于德州驢產(chǎn)奶量的研究很少，本研究首次利用蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究了德州驢乳清蛋白變異，并分析了幾個(gè)影響德州驢產(chǎn)奶量蛋白質(zhì)的生物學(xué)作用。

在本研究 中 ，HSPA8、HSP90AA1（HSP90α）和HSP90AB1（HSP90β）在高產(chǎn)驢奶中顯著上調(diào)。HSPA8作為ATP依賴性分子伴侶發(fā)揮作用，參與蛋白質(zhì)折疊、細(xì)胞蛋白質(zhì)降解和蛋白質(zhì)輸入［11］，且HSPA8在包含p38 MAPK的基于乳蛋白合成的網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)中也起著重要作用［12］。HSPA8在泌乳高峰階段上調(diào)，有助于細(xì)胞骨架的形成和功能以及乳汁的產(chǎn)生［13］。HSP90AA1和HSP90AB1是兩種主要的HSP90細(xì)胞質(zhì)同種型，它們起分子伴侶的作用，并促成幾種細(xì)胞過程，包括信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和凋亡［14］。HSP90 維持 Akt激酶活性［15］，HSP90AA1/HSPA8 的高表達(dá)與PI3K/Akt通路的激活相關(guān)，這在哺乳期間合成乳成分尤其是脂質(zhì)和乳糖是重要的［16］。HSP90與STAT5相互作用并促進(jìn)其活化的許多步驟［17］，后者參與乳腺發(fā)育并通過JAK2/STAT5途徑控制乳蛋白表達(dá)［18］。這些HSP在高產(chǎn)德州驢奶樣品中的表達(dá)增加，表明它們作為潛在的分子標(biāo)記物的重要性，可為下一步研究其與產(chǎn)奶性狀的關(guān)聯(lián)性奠定了基礎(chǔ)。

在哺乳期間，乳腺上皮細(xì)胞的減少導(dǎo)致奶產(chǎn)量下降。細(xì)胞數(shù)量減少歸因于細(xì)胞的持續(xù)凋亡，這已被認(rèn)為是泌乳后期產(chǎn)奶量下降的主要原因［19］。最大限度地減少細(xì)胞凋亡可以提高泌乳量［20］。本研究中，檢測到的差異蛋白質(zhì)，如 HSPA8、HSP90AA1、HSP90AB1、CSE1L 和KRT18，可能與抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)。HSP90可能加強(qiáng)糖酵解和增殖并減少細(xì)胞凋亡［21］。HSPA8的敲除顯著降低細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞生長［22］。CSE1L在大多數(shù)癌癥類型中高度表達(dá)。用CSE1L siRNA處理癌細(xì)胞后，細(xì)胞活力降低，細(xì)胞凋亡增加，表明其具有抗細(xì)胞凋亡作用［23］。KRT18是另一種作為角蛋白成員的上調(diào)蛋白，與KRT8共表達(dá)，對FAS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡具有抗性［24］。在高產(chǎn)組中的上調(diào)的蛋白質(zhì)，表明它們可能參與抗細(xì)胞凋亡作用，防止哺乳后期由細(xì)胞凋亡引起的乳腺上皮細(xì)胞數(shù)量的減少，這可能導(dǎo)致產(chǎn)奶量的增加。

總之，本研究通過非標(biāo)記的定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法，對不同產(chǎn)奶量德州驢個(gè)體間差異表達(dá)的乳清蛋白進(jìn)行了綜合分析，增加了人們對驢泌乳過程中特定途徑和蛋白質(zhì)的認(rèn)知。首次描述了乳清蛋白的表達(dá)譜，探索了與德州驢乳產(chǎn)量性狀相關(guān)的分子機(jī)制，有助于為高產(chǎn)奶驢的選育篩選生物標(biāo)記。