患病草魚腸道病原菌的分離鑒定及毒力研究

鄒 升，龔 亮，李東杰，曹麗娜，李艷平，何昊城，丁學知，易敢峰,2，夏立秋

( 1.湖南師范大學 生命科學學院，淡水魚類發(fā)育生物學國家重點實驗室，微生物分子生物學 湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410081； 2.大北農水產科技集團，福建 詔安 363500 )

洞庭湖是中國第二大淡水湖，為我國淡水漁業(yè)發(fā)源地之一[1]，其淡水水產品在全國占有較大比重和重要地位，逐漸成為我國魚類養(yǎng)殖的主要產區(qū)和高產區(qū)[2]。按品種劃分，洞庭湖淡水養(yǎng)殖中所占比重較高的是草魚(Ctenopharynodonidellus)、鯽魚(Carassiusauratus)、鰱魚(Hypophthalmichthysmolitrix)、鳙魚(Aristichthysnobilis)和鯉魚(Cyprinuscarpio)[3]。

近年來，隨著精養(yǎng)密度的加大，飼料投喂量增加及漁藥使用頻繁，導致水質惡化，養(yǎng)殖病害頻發(fā)。其中細菌性疾病是主要病害，嚴重制約和危害了淡水養(yǎng)殖業(yè)的健康和可持續(xù)發(fā)展[4]。目前，在環(huán)洞庭湖區(qū)普遍流行的細菌性疾病有出血病、爛鰓病、腸炎病、赤皮病，這些病對各養(yǎng)殖品種都造成了較大的危害，其中以草魚、鯉魚、鰱魚和鳙魚的死亡率最高[5]。

2017年4—6月，在環(huán)洞庭湖區(qū)的安鄉(xiāng)、南縣、華容、湘陰和望城等地精養(yǎng)魚池暴發(fā)了較大范圍的草魚疾病，出現(xiàn)草魚大面積的死亡現(xiàn)象。發(fā)病草魚均表現(xiàn)為游動緩慢、反應遲鈍，食欲減退、部分魚體出現(xiàn)脫鱗，該病持續(xù)時間較長，短期內可導致草魚大量死亡。

筆者對湖南環(huán)洞庭湖區(qū)上述地區(qū)漁場患病瀕臨死亡草魚的腸道進行了病原菌分離、鑒定，并針對病原菌的生物學特性、致病性、藥物敏感性及毒力因子攜帶情況等進行研究，旨在探索誘發(fā)該暴發(fā)病的主要病原及其生物學特性，為魚類健康養(yǎng)殖及病害防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2017年4—6月，從環(huán)洞庭湖區(qū)的安鄉(xiāng)、南縣、華容、湘陰和望城等地精養(yǎng)魚池采集患病瀕臨死亡的草魚55尾。發(fā)病癥狀表現(xiàn)為體表鱗片有脫落，胸鰭鰭條基部有出血癥狀，肛門紅腫，鰓絲灰白，剖檢可見體內血液稠黑，肝胰臟發(fā)黃。取具有典型癥狀且發(fā)病癥狀明顯的患病草魚，用75%酒精擦拭魚體表，于無菌操作臺中進行解剖，取病變明顯的腸道組織及其內容物，4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化鈉10 g/L。

LB固體培養(yǎng)基：在LB液體培養(yǎng)基中加2%的瓊脂粉。

1.3 主要試劑及儀器

細菌基因組提取試劑盒、質粒提取試劑盒、PCR產物純化試劑盒、膠回收試劑盒、引物合成(上海生工生物試劑有限公司)?？股厮幟艏埰?上海易佰聚經貿有限公司)；pMD-18 T載體、TaKaRa ExTaqDNA酶、Hind Ⅲ、EcoR Ⅰ、DL-2000Marker、DL-5000Marker[寶生物工程(大連)有限公司]。脫纖維綿羊血血平板、培養(yǎng)基試劑(長沙天恒生物技術科技有限公司)。冷場電子掃描顯微鏡(Hitachi Su8010)(日立公司)，凝膠成像儀(美國Kodak公司)，PCR 擴增儀(德國Eppendorf公司)，電泳儀(北京六一儀器廠)。

1.4 病原菌的分離

將腸道組織樣本及其內容物加入無菌水研磨搗碎，吸取上清稀釋液涂布于LB固體培養(yǎng)基平板上，30 ℃培養(yǎng)24 h后挑取優(yōu)勢單菌落再次劃線純化，純化的菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中于30 ℃搖床培養(yǎng)24 h，之后保種于25%無菌甘油中，-80 ℃冰箱中凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 菌株的形態(tài)觀察

分離得到的優(yōu)勢菌株分別接種于LB固體培養(yǎng)基平板上，置于30 ℃ 培養(yǎng)24 h ，取菌體涂片，革蘭氏染色后用光學顯微鏡觀察菌體形態(tài)和染色特征，同時用冷場電子束掃描電鏡觀察菌株細胞形態(tài)學特征。

1.6 菌株鑒定及分類

1.6.1 16S rRNA基因與gyrB管家基因的擴增與測序

菌株于30 ℃振蕩搖床培養(yǎng)12 h，利用細菌基因組提取試劑盒(生工公司)提取細菌基因組，利用16S rRNA基因通用引物(引物序列為，27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492R：5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)和gyrB管家基因通用引物(UP1：5′-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3′，UP2R：AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACR TCNGCRTCNGTCAT)擴增菌株對應的基因序列[6]，序列預期長度分別約為1500 bp和1200 bp。 PCR反應體系(20 μL)：2 μL Ex Taq Buffer(10×)，1.6 μL dNTP Mixture(2.5 mmol/L)，上游引物0.6 μL(10 μmol/L)、下游引物 0.6 μL(10 μmol/L)，模板 1 μL，0.2 μL TaKaRa Ex Taq(5 U/μL)，14 μL H2O。PCR反應程序：95 ℃預變性5 min； 95 ℃，45 s，55 ℃，45 s，72 ℃，1.5 min，30個循環(huán)；72 ℃，10 min。

16S rRNA基因和gyrB管家基因PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收。回收產物用pMD-18T vector進行連接，之后轉化到大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α感受態(tài)細胞中，進行氨芐抗性篩選，挑取單克隆培養(yǎng)后提取質粒，酶切鑒定后送至上海生工進行測序。

1.6.2 系統(tǒng)發(fā)育樹的構建

用BLAST將菌株的16S rRNA基因和gyrB管家基因測序結果與GenBank中登錄的序列進行比對，運用Mega 6.06，采用鄰接法構建系統(tǒng)發(fā)育樹(重復數(shù)為1000，步長值取百分比)。

1.7 回歸感染試驗

病原菌分別活化和擴大培養(yǎng)后，離心收集菌體，用0.85%無菌生理鹽水將其分別稀釋制備成1×108、5.0×108cfu/mL的菌懸液。將試驗用的健康草魚隨機分成試驗組和對照組，每組10尾[體質量為(37.2±11.0) g]。試驗組菌液注射劑量為0.2 mL/尾，對照組注射生理鹽水0.2 mL/尾?；貧w感染試驗開始前暫養(yǎng)草魚停食48 h。試驗采用腹腔注射法，試驗期間水溫20～23 ℃，連續(xù)觀察并記錄各組草魚的發(fā)病和死亡情況。并對死亡草魚及時進行解剖和病原菌的再次分離[7]，患病試驗魚按照1.4方法進行細菌的再分離。

1.8 藥敏試驗

選用分別含紅霉素、四環(huán)素、多黏菌素、利福平、萬古霉素、氨芐西林、氯霉素、慶大霉素、壯觀霉素、卡那霉素、復方新諾明的11種抗生素藥敏紙片對病原菌進行藥敏試驗。采用Kirby-Bauer擴散法，將經18 h培養(yǎng)的新鮮菌液用無菌水稀釋成1.0×108cfu/mL后的菌懸液均勻涂布于LB瓊脂平板，室溫干燥3～5 min后用鑷子將藥敏紙片貼于培養(yǎng)基表面，于30 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后取出，用游標卡尺測量抑菌圈的直徑。

1.9 脫脂纖維綿羊血血平板試驗

將病原菌菌株分別接種于LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃振蕩培養(yǎng)12 h后，菌液密度稀釋到1×108cfu/mL。將脫脂纖維綿羊血血平板自4 ℃冰箱中取出，在超凈臺恢復至室溫。然后吸取10 μL菌液接種于血平板上，并以嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)作為陽性對照，置于30 ℃培養(yǎng)48 h，觀察其溶血情況并記錄[8]。

1.10 毒力基因檢測

毒力基因的引物根據(jù)GenBank收錄和參考相關文獻設計[9]，設計毒力基因氣溶素、細胞毒性腸毒素、黏附素、絲氨酸蛋白酶、核酸酶和S-核糖基高半胱氨酸酶基因的引物，設計的6對引物及片段大小見表1。PCR反應程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃，45 s，55 ℃，45 s，72 ℃，1.5 min，30個循環(huán)；72 ℃，10 min。

表1 PCR擴增所用的引物及片段大小

2 結 果

2.1 4種病原菌的形態(tài)特征

自環(huán)洞庭湖區(qū)5個縣區(qū)的漁場患暴發(fā)病瀕臨死亡的草魚腸道中分離獲得4株優(yōu)勢菌株，分別為AsB002、AaB007、PSB008和LgB010，其中菌株AsB002為革蘭氏陰性菌，菌落形態(tài)呈圓形，米黃色，光滑濕潤。菌株AaB007為革蘭氏陰性菌，菌落形態(tài)呈米黃色圓形菌落，表面光滑濕潤，中央微隆起。菌株PSB008為革蘭氏陰性菌，菌落形態(tài)呈乳白色圓形，不透明，表面濕潤光滑，用鞭毛染色液染色后可以觀察到細長的鞭毛(圖1)。菌株LgB010為革蘭氏陽性菌，菌落形態(tài)呈灰白色圓形，濕潤、不透明。4株菌株在光學顯微鏡和掃描電鏡下觀察均為桿狀(圖2、圖3)。

2.2 病原菌的鑒定及分類

以4株菌株的基因組為模板，利用16S rRNA基因通用引物和gyrB管家基因通用引物PCR擴增菌株對應的基因序列，片段長度大小分別為1200 bp和1500 bp(圖4)，片段與pMD-18T vector連接后進行了質粒檢測(圖5)和酶切鑒定(圖6)，結果顯示連接成功。擴增測序結果BLAST比對分析顯示，菌株AsB002、AaB007、PSB008、LgB010分別為溫和氣單胞菌(A.sobria)、異常嗜糖氣單胞菌(A.allosaccharophila)、類志賀鄰單胞菌(Plesiomonasshigelloides)、格氏乳球菌(Lactococcusgarvieae)，并對4種病原菌構建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖7～圖10)。

圖1 菌株PSB008鞭毛染色的相差顯微鏡觀察(1000×)

圖2 4株菌株形態(tài)學觀察a.4株菌株的相差顯微鏡觀察(1000×)，b.4株菌株的革蘭氏染色(1000×)，c.4株菌株平板菌落形態(tài).

圖3 4株菌株的冷場掃描電鏡觀察a.10000×，b.25000×.

圖4 4種病原菌PCR檢測a.4種病原菌的16S rRNA基因PCR檢測，b.4種病原菌的gyrB管家基因PCR檢測. M. DL 5000 DNA Marker，1.菌株AsB002，2.菌株AaB007，3.菌株PSB008，4.菌株LgB010.下同.

圖5 4種病原菌的gyrB-T質粒檢測

圖6 4種病原菌的gyrB-T雙酶切檢測

圖7 根據(jù)菌株AsB002 gyrB基因序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖8 根據(jù)菌株AaB007 gyrB基因序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖9 根據(jù)菌株PSB008 gyrB基因序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖10 根據(jù)菌株LgB010 16S rRNA基因序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 回歸感染試驗結果

將4種病原菌分別注射到健康草魚體內(表2)，感染48 h后，當病原菌密度達到1.0×108cfu/mL、注射量為200 μL/尾時，草魚開始出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，發(fā)病癥狀與自然感染死亡的癥狀一致(圖11)，而對照組未見死亡。對感染死亡的草魚腹水及腸道中的優(yōu)勢菌進行形態(tài)觀察及分子鑒定(圖12)，結果均顯示是相應感染的病原菌。

2.4 藥敏試驗結果

4種病原菌對多種抗生素耐受性較強，但均對氯霉素敏感，除此之外，四環(huán)素、卡那霉素、復方新諾明能使2種以上的病原菌表現(xiàn)不同程度的敏感性(表3)。

表2 4種病原菌感染草魚的致死情況

圖11 4種病原菌株感染草魚的癥狀及對體內病原菌株的再分離a.溫和氣單胞菌AsB002，b.異常嗜糖氣單胞菌AaB007，c.類志賀鄰單胞菌PSB008，d.格氏乳球菌LgB010.

圖12 回歸感染死亡的草魚體內病原菌株的gyrB管家基因PCR檢測M. DL 5000 DNA Marker，a～d. 依次為自感染溫和氣單胞菌AsB002、異常嗜糖氣單胞菌AaB007、類志賀鄰單胞菌PSB008、格氏乳球菌LgB010死亡草魚體內分離的病原菌.

抗生素溫和氣單胞菌AsB002異常嗜糖氣單胞菌AaB007類志賀鄰單胞菌PSB008格氏乳球菌LgB010抑菌圈范圍/mm紅霉素RRRIR≤12,I:13～17,S≥18四環(huán)素IRIIR≤14,I:15～18,S≥19多黏菌素RRRRR≤12,S>12利福平RRRRR≤16,I:17～19,S≥20萬古霉素RRRSR≤13,I:13～15,S≥15氨芐西林RRRSR≤11,I:12～14,S≥15氯霉素SSSIR≤12,I:13～17,S≥18慶大霉素RRRIR≤12,I:13～14,S≥15壯觀霉素RRSRR≤14,I:15～17,S≥18卡那霉素IIRRR≤13,I:14～17,S≥18復方新諾明IISRR≤10,I:11～17,S≥16

注：“S”為高敏；“I”為中敏；“R”為耐藥.

2.5 脫脂纖維綿羊血血平板試驗結果

在脫脂纖維綿羊血平板上，溫和氣單胞菌AsB002、異常嗜糖氣單胞菌AaB007具有溶血現(xiàn)象，與陽性對照嗜水氣單胞菌現(xiàn)象一致，而類志賀鄰單胞菌PSB008、格氏乳球菌LgB010未發(fā)現(xiàn)溶血現(xiàn)象(圖13)。

圖13 4種病原菌溶血活性檢測；a.溫和氣單胞菌AsB002， b.異常嗜糖氣單胞菌AaB007， c.類志賀鄰單胞菌PSB008， d.格氏乳球菌LgB010， e.嗜水氣單胞菌(對照).

2.6 毒力基因檢測試驗結果

PCR擴增片段電泳檢測顯示，溫和氣單胞菌AsB002的毒力基因檢測中的1、2、4、5、6泳道條帶大小與預期的S-核糖基高半胱氨酸酶基因、核酸酶、黏附素、氣溶素、細胞毒性腸毒素片段大小一致(圖14)，異常嗜糖氣單胞菌AaB007的毒力基因檢測中的1、2、3、5、6泳道條帶大小與預期的S-核糖基高半胱氨酸酶基因、核酸酶、氣溶素、絲氨酸蛋白酶、黏附素片段大小一致(圖15)，類志賀鄰單胞菌PSB008的毒力基因檢測中的4、6泳道條帶大小與預期的S-核糖基高半胱氨酸酶基因、黏附素片段大小一致(圖16)，格氏乳球菌LgB010的毒力基因檢測中的1泳道條帶大小與預期的氣溶素片段大小一致(圖17)。

圖14 溫和氣單胞菌AsB002菌株的毒力基因檢測1.S-核糖基高半胱氨酸酶基因， 2.核酸酶基因， 3.絲氨酸蛋白酶基因， 4.黏附素基因， 5.氣溶素基因， 6.細胞毒性腸毒素基因.

圖15 異常嗜糖氣單胞菌AaB007菌株的毒力基因檢測1.S-核糖基高半胱氨酸酶基因， 2.核酸酶基因， 3.氣溶素基因， 4.細胞毒性腸毒素基因， 5.絲氨酸蛋白酶基因， 6.黏附素基因.

圖16 類志賀鄰單胞菌PSB008菌株的毒力基因檢測1.細胞毒性腸毒素基因， 2.氣溶素基因， 3.絲氨酸蛋白酶基因， 4.S-核糖基高半胱氨酸酶基因， 5.核酸酶基因， 6.黏附素基因.

圖17 格氏乳球菌LgB010菌株的毒力基因檢測1.氣溶素基因， 2.細胞毒性腸毒素基因， 3.核酸酶基因， 4.S-核糖基高半胱氨酸酶基因， 5.絲氨酸蛋白酶基因， 6.黏附素基因.

3 討 論

3.1 病原菌的分離和鑒定

草魚作為湖南環(huán)洞庭湖區(qū)精養(yǎng)魚池主養(yǎng)品種，年產量近5.0×105t，約占養(yǎng)殖總量的70%。但近年來草魚病害暴發(fā)加重[10]，從各養(yǎng)殖品種所占比例來看，草魚的發(fā)病面積占總發(fā)病面積的54%，而死亡數(shù)量占總發(fā)病死亡數(shù)量的50%[5]。本研究自環(huán)洞庭湖區(qū)漁場患暴發(fā)病瀕臨死亡草魚的腸道中分離得到4種病原菌，分別是溫和氣單胞菌AsB002、異常嗜糖氣單胞菌AaB007、類志賀鄰單胞菌PSB008、格氏乳球菌LgB010。其中，溫和氣單胞菌是危害我國淡水養(yǎng)殖業(yè)的重要病原菌之一[11]，能引起魚類、爬行類、兩棲類等冷血動物的敗血癥[12]。該菌主要在草魚、鯽魚[13]、鯉魚[14]、大麻哈魚(Oncorhynchusketa)[15]中發(fā)病較多，也是重要的人畜共患病的病原菌，能引發(fā)腹瀉、傷口感染和敗血癥等癥狀[16]。異常嗜糖氣單胞菌[17]常見于施氏鱘(Acipenserschrenckii)[18]中，是一種條件致病菌，在條件合適時會大量繁殖，導致魚體發(fā)病。類志賀鄰單胞菌感染后病魚主要癥狀為魚眼球突出、鰓絲發(fā)白、體表浮腫、肌肉糜爛、肛門紅腫[19]，主要感染草魚[20]、鯽魚[21]、莫桑比克羅非魚(Oreochromismossambicus)[22]、青魚(Mylopharyngodonpiceus)[23]等，同時也是重要的人畜共患病的病原菌[24]。格氏乳球菌可引發(fā)腸炎、肝臟貧血及腹腔出血等病癥[25]。

本研究對4種病原菌進行了形態(tài)學、病理學的研究。該4種病原菌在洞庭湖區(qū)范圍內發(fā)病情況少見報道，因此為加強環(huán)洞庭湖區(qū)草魚精養(yǎng)魚池健康養(yǎng)殖定期出現(xiàn)的病害防治提供了科學依據(jù)。

3.2 病原菌的毒力研究

4種病原菌對多種抗生素具有耐受性，但均對氯霉素敏感，除此之外，四環(huán)素、卡那霉素、復方新諾明能使2種以上的病原菌表現(xiàn)不同程度的敏感性。氯霉素屬于廣譜性抗生素，它通過與核糖體的50S亞單位結合從而抑制細菌蛋白質的合成，對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均具有較好的抑制作用[26]。但是氯霉素毒副作用較大[27]，因此規(guī)定在水產品中“不得檢出”[28]。這說明，對本試驗分離得到的4種病原菌引起的草魚病害問題防治的關鍵是篩選和研發(fā)新的防治藥物，篩選出具有廣譜性的拮抗菌來對抗這4種病原菌可能會成為有效的防控措施。同時，高度重視對水產微生物制劑的研發(fā)，實施健康生態(tài)養(yǎng)殖，實現(xiàn)環(huán)洞庭湖區(qū)水產養(yǎng)殖的可持續(xù)發(fā)展。

分別對4種病原菌進行回歸感染，結果顯示，當4種病原菌密度分別為5.0×108cfu/mL時，注射量為200 μL/尾時，草魚的致死率高達100%，并可自體內分離到相應感染的病原菌。4種病原菌對草魚的危害巨大，表明本次草魚患暴發(fā)病的病原菌主要為上述4種病原菌。

脫纖維綿羊血血平板上檢測到了溫和氣單胞菌AsB002、異常嗜糖氣單胞菌AaB007的溶血活性，可能具有溶血素基因，而類志賀鄰單胞菌PSB008、格氏乳球菌LgB010未檢測到。王海娟等[7,29]自溫和氣單胞菌中克隆擴增出溶血素基因，構建重組了溶血素，并檢測了活性。這說明溶血素基因在多種不同來源的溫和氣單胞菌中存在。在許多致病菌中，溶血素均作為重要的毒力基因參與細胞的致病過程[30]，例如，霍亂弧菌(Vibriocholerae)溶血素能裂解紅細胞和其他多種哺乳動物細胞[31]。另外，對4種病原菌的毒力基因進行了研究，毒力基因與魚的致病性有關[32]，而毒力基因具有一定的保守性，因此以維氏氣單胞菌(A.veronii)的毒力基因設計6對引物[9]，來探究4種病原菌可能攜帶的毒力基因。目前，溫和氣單胞菌、異常嗜糖氣單胞菌、類志賀鄰單胞菌、格氏乳球菌4株菌的毒力基因研究較少。本試驗的4種病原菌可能攜帶的毒力基因有待進一步鑒定。

目前，洞庭湖區(qū)淡水魚類病害研究還不成熟，有些疾病的病原還不能完全確定，許多治療方法的研究需要進一步理論驗證。加強病原菌及流行病學等基礎研究力度，為今后生態(tài)防治方法的研究，如水體調控、生物調控等措施打下基礎，最終實現(xiàn)淡水魚類的健康養(yǎng)殖。