TLR4-NFκB信號通路在順鉑致胃癌SGC-7901細胞凋亡中的作用

段永慶

(昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院胃腸外科，云南昆明650000)

胃癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，以順鉑為基礎(chǔ)的一線化療方案是胃癌常用的治療方法，但是研究發(fā)現(xiàn)約50%的胃癌患者對順鉑已產(chǎn)生耐藥性，可能由于癌細胞表面P-糖蛋白過度表達，從而將順鉑從細胞內(nèi)泵出細胞外[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，化療藥物可以在各種腫瘤細胞系中普遍誘導(dǎo)NFκB和各種炎性細胞因子的表達，顯著降低了化療藥物的致凋亡效應(yīng)，提示NFκB介導(dǎo)的炎癥信號通路參與腫瘤細胞的藥物抵抗[3-6]。TLR4是一種模式識別受體，可以與外界微生物、自身降解物、藥物等相互作用，激活下游NFκB介導(dǎo)的炎癥信號通路[7-8]。盡管如此，關(guān)于TLR4-NFκB信號通路在順鉑致胃癌SGC-7901細胞凋亡中的作用，仍然缺乏直接有效的證據(jù)，因此我們在本文中通過構(gòu)建TLR4 siRNA阻斷TLR4-NFκB信號通路，以觀察胃癌SGC-7901細胞在順鉑致凋亡作用中的變化。

1 材料與方法

1.1 SGC-7901細胞培養(yǎng)與順鉑處理

人胃癌SGC-7901細胞購買于中國科學(xué)院細胞庫。使用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)于37℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中，當(dāng)細胞培養(yǎng)至匯合度達到70%左右時，加入0.25%的胰蛋白酶消化，使用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液終止后進行傳代培養(yǎng)。將SGC-7901細胞分為兩組，即正常對照組(Control group)和順鉑處理組(DDP group)。順鉑處理組細胞中加入終濃度為10 μmol/L的順鉑處理12 h，加入相同體積的PBS作為正常對照組。處理12 h后收集細胞，使用Western blot檢測SGC-7901細胞中TLR4和NFκB的表達情況。

1.2 TLR4 siRNA的轉(zhuǎn)染

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫TLR4核苷酸序列(ND-7099)，設(shè)計合成TLR4 siRNA序列(Anti-TLR4)和無義序列(Scramb-Anti-TLR4)，具體序列見表1。轉(zhuǎn)染前以5105個/孔的細胞數(shù)將SGC-7901細胞接種至6孔細胞培養(yǎng)板，加入10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)至匯合度70%左右，吸棄培養(yǎng)基后加入PBS洗滌，加入1500 μL無血清的RPMI 1640培養(yǎng)基。將5 μL的siRNA與250 μL的RPMI 1640培養(yǎng)基混合，靜置5 min，配置成溶液1；將5 μL的LipofectamineTM2000與250 μL的RPMI 1640培養(yǎng)基混合，靜置5 min，配置成溶液2；將溶液1與溶液2混合后，室溫靜置20 min，以形成siRNA-LipofectamineTM2000復(fù)合物，即轉(zhuǎn)染液。將轉(zhuǎn)染液加入至6孔板中，輕輕混勻后放置于細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)6 h，轉(zhuǎn)染結(jié)束后吸棄培養(yǎng)基加入PBS洗滌，使用10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。隨后，兩組細胞，即無義序列轉(zhuǎn)染組(Scramb-Anti-TLR4 group)和TLR4 siRNA序列轉(zhuǎn)染組(Anti-TLR4 group)(見表1)，均加入終濃度為10 μmol/L的順鉑處理，處理12 h后收集細胞，用于后續(xù)的Western blot和流式細胞術(shù)檢測。

表1 siRNA序列

1.3 Western blot檢測

取105個細胞，加入100 μL的細胞裂解液和終濃度為1 mM的PMSF，混勻后充分裂解。使用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測總蛋白濃度，取40 μg蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)。每4 μL的蛋白質(zhì)溶液加入1 μL的5SDS-PAGE上樣緩沖液，混勻后，100℃水浴中將蛋白變性5 min，冷卻至室溫后上樣進行電泳，藍色染料到達膠底部時停止電泳。在冰水浴中以100 mA恒流轉(zhuǎn)膜2 h，將轉(zhuǎn)膜后的聚偏二氟乙烯膜用5%的脫脂奶粉室溫封閉2 h，用抗TLR4抗體(1∶500)、抗NFκB抗體(1∶2000)、抗Bax抗體(1∶1000)、抗Bcl-2抗體(1∶1000)、抗Activecaspase-3抗體(1∶500)、抗GAPDH抗體(1∶5000)4℃過夜孵育。洗滌3次后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1∶2000)，室溫孵育1 h，洗滌3次后，加入ECL顯色液后于凝膠成像儀下曝光和拍照。使用ImageJ測定灰度值，將對照組的灰度值設(shè)置為1。

1.4 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡和壞死

使用Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒檢測，具體步驟為：取105個細胞，1000 g離心5 min后，加入195 μL的Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細胞，加入5 μL的AnnexinV-FITC和10 μL的碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)染色液，混勻，室溫避光孵育20 min后置于冰上，使用流式細胞儀檢測。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

分別使用SPSS 20.0軟件和Graph Pad Prism 6.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理和作圖，所有計量數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間計量數(shù)據(jù)的比較使用t檢驗。當(dāng)P<0.01時，以**表示。

2 結(jié)果

2.1 順鉑對SGC-7901細胞TLR4和NFκB表達的影響

Western blot的結(jié)果顯示，與不經(jīng)順鉑處理的正常對照組相比較，順鉑處理后TLR4(t=14.070,P<0.001)和NFκB(t=17.660,P<0.001)的表達顯著增加(見圖1A-D)。

圖1 順鉑對SGC-7901細胞TLR4和NFκB表達的影響

A：Western blot檢測TLR4的表達，B：Western blot檢測NFκB的表達，C：TLR4表達的灰度值統(tǒng)計圖，D：NFκB表達的灰度值統(tǒng)計圖。**P<0.01。

2.2 TLR4 siRNA轉(zhuǎn)染對順鉑誘導(dǎo)SGC-7901細胞TLR4和NFκB表達的影響

Western blot的結(jié)果顯示，與Scramb-Anti-TLR4無義序列轉(zhuǎn)染的SGC-7901細胞相比較，Anti-TLR4序列轉(zhuǎn)染組在順鉑處理后TLR4(t=16.810,P<0.001)和NFκB(t=15.040,P<0.001)表達顯著下降(見圖2A-D)。

圖2 TLR4 siRNA轉(zhuǎn)染對順鉑誘導(dǎo)SGC-7901細胞TLR4和NFκB表達的影響

A-B：Western blot檢測Scramb-Anti-TLR4和Anti-TLR4序列轉(zhuǎn)染的SGC-7901細胞經(jīng)順鉑處理后的TLR4和NFκB的表達情況，C-D：兩組細胞TLR4和NFκB表達的比較。**P<0.01。

2.3 TLR4 siRNA轉(zhuǎn)染對順鉑誘導(dǎo)SGC-7901細胞凋亡相關(guān)蛋白表達的影響

Western blot的結(jié)果顯示，與Scramb-Anti-TLR4無義序列轉(zhuǎn)染的SGC-7901細胞相比較，Anti-TLR4序列轉(zhuǎn)染組在順鉑處理后Bax(t=17.870,P<0.001)和Activecaspase-3(t=8.881,P<0.001)表達顯著升高，Bcl-2(t=17.300,P<0.001)表達顯著下降(見圖3A-B)。

圖3 TLR4 siRNA轉(zhuǎn)染對順鉑誘導(dǎo)SGC-7901細胞凋亡相關(guān)蛋白表達的影響

A：Western blot檢測Scramb-Anti-TLR4和Anti-TLR4序列轉(zhuǎn)染的SGC-7901細胞經(jīng)順鉑處理后的Bax、Bcl-2、Activecaspase-3的表達情況，B：兩組細胞Bax、Bcl-2、Activecaspase-3表達的比較。**P<0.01。

2.4 TLR4 siRNA轉(zhuǎn)染對順鉑誘導(dǎo)SGC-7901細胞凋亡和壞死的影響

流式細胞術(shù)的結(jié)果顯示，與Scramb-Anti-TLR4無義序列轉(zhuǎn)染的SGC-7901細胞相比較，Anti-TLR4序列轉(zhuǎn)染組在順鉑處理后細胞凋亡率(t=4.122,P<0.001)和壞死率(t=9.367,P<0.001)均顯著升高(見圖4A-D)。

圖4 TLR4 siRNA轉(zhuǎn)染對順鉑誘導(dǎo)SGC-7901細胞凋亡和壞死的影響

A-B：流式細胞術(shù)檢測Scramb-Anti-TLR4和Anti-TLR4序列轉(zhuǎn)染的SGC-7901細胞經(jīng)順鉑處理后的細胞凋亡和壞死情況。C-D：兩組細胞凋亡率和壞死率的比較。Q1：檢測誤差，Q2：壞死細胞，Q3：正常細胞，Q4：凋亡細胞，**P<0.01。

3 討論

TLR4是模式受體家族中的成員，主要表達于抗原提呈細胞，但也廣泛的表達于一系列腫瘤細胞系中，如sLNCaP、DU145、PC3、PANC-1、BxPC-3等[9-10]。TLR4不僅參與感染的免疫抵抗，也在腫瘤的起始和進展中發(fā)揮關(guān)鍵的病理作用，如TLR4可以促進人非小細胞肺癌細胞的免疫逃逸，支持卵巢癌細胞的生長和增殖，增強結(jié)直腸癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[11-12]。Li等[13]人發(fā)現(xiàn)TLR4在非小細胞肺癌患者中高表達，而且表達水平與腫瘤的分期和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，通過RNA干擾TLR4的表達可以顯著抑制A549細胞的增殖，誘導(dǎo)細胞的凋亡，提示TLR4也可能在腫瘤細胞的耐藥機制中發(fā)揮作用。我們在本文中也發(fā)現(xiàn)順鉑可以誘導(dǎo)胃癌SGC-7901細胞的TLR4表達，通過siRNA特異性阻斷TLR4表達后，可以增強凋亡促進蛋白Bax、Activecaspase-3的表達，抑制凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達，使SGC-7901細胞在順鉑處理后的凋亡率與壞死率均顯著升高，因此TLR4的阻斷可以作為順鉑治療胃癌的輔助方法[14]。

NFκB是TLR4下游重要的效應(yīng)分子，其介導(dǎo)的炎癥信號通路可被各種化療藥物誘導(dǎo)激活，尤其是在鉑類、蒽環(huán)類、紫杉烷化療藥物中表現(xiàn)更為突出[15]。通過阻斷NFκB的表達可以顯著增強化療藥物的致凋亡效應(yīng)[16-18]，例如硼替佐米是目前唯一一種批準(zhǔn)進入臨床的蛋白酶體抑制劑，可以抑制NFκB的表達和活性，防止NFκB依賴的細胞幸存途徑的激活，已被廣泛的用于肺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、白血病等腫瘤中的治療[19-20]。我們在本文也發(fā)現(xiàn)，順鉑可以誘導(dǎo)胃癌SGC-7901細胞的NFκB表達，在特異性阻斷TLR4表達后，NFκB的表達也隨之降低，最終引起SGC-7901細胞在順鉑處理后凋亡率與壞死率均顯著升高，因此TLR4-NFκB信號通路在順鉑致胃癌SGC-7901細胞凋亡中發(fā)揮抑制作用，可能是胃癌細胞對順鉑耐藥的主要機制。

盡管本研究初步探討了TLR4-NFκB信號通路在順鉑致胃癌SGC-7901細胞凋亡中的抑制作用，但是仍然有許多不足之處：①本文僅使用了普通的SGC-7901細胞作為研究對象，TLR4-NFκB信號通路是否在胃癌耐藥細胞株SGC-7901/DDP中發(fā)揮同樣的凋亡抑制作用仍然需要進一步研究；②本文僅將TLR4進行特異性阻斷以研究后續(xù)的生物學(xué)效應(yīng)，而阻斷NFκB又能否達到相同的凋亡增強效應(yīng)，分別阻斷兩種分子對胃癌細胞的凋亡率是否有差異；③本文僅在體外細胞水平探討TLR4-NFκB信號通路的作用，實驗結(jié)果的穩(wěn)定性和可靠性均不如動物實驗，因此仍然需要進一步構(gòu)建體內(nèi)動物模型以驗證結(jié)論；④TLR4作為一種模式識別受體，盡管NFκB是其下游的主要效應(yīng)分子，但仍然有眾多其他效應(yīng)通路，因此阻斷TLR4高表達的凋亡增強效應(yīng)是否有其他下游信號通路參與。

綜上所述，順鉑可以激活胃癌SGC-7901細胞的TLR4-NFκB信號通路，抑制TLR4-NFκB信號通路可以增強順鉑的致凋亡效應(yīng)。我們未來將進一步探討TLR4-NFκB信號通路在胃癌耐藥細胞株SGC-7901/DDP和體內(nèi)動物模型中的作用，深入的探討其作用機制，并使用抗體、藥物等方式阻斷關(guān)鍵性分子以開展治療性研究。