齊墩果酸拮抗赭曲霉毒素A誘導(dǎo)的HEK293T細(xì)胞自噬性死亡

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(1.遵義醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,貴州遵義 563000; 2.貴州省預(yù)防醫(yī)學(xué)實驗教學(xué)示范中心,貴州遵義 563000; 3.遵義醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,貴州遵義 563000)

赭曲霉毒素A(ochratoxin A,OTA)是由曲霉菌屬和青霉屬等絲狀真菌產(chǎn)生的低分子量次級代謝產(chǎn)物[1]。飼料[2]和食品中都存在廣泛的OTA污染。報道的OTA污染的食品或食品原料包括谷物及其制品、肉類、雞蛋、乳制品、干制品、蔬菜、水果、葡萄酒、豆類、堅果、香料、嬰幼兒谷物甚至嬰兒配方奶粉[3]。因此,很難完全避免OTA暴露的風(fēng)險。1993年,OTA被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)歸類為2B類致癌物(可能的人類致癌物)。雖然OTA沒有像黃曲霉毒素那樣被歸類為1類致癌物(人類致癌物),但這并不意味著OTA毒性明顯低于黃曲霉毒素,只是因為OTA致癌的人類流行病學(xué)證據(jù)非常稀少,不如黃曲霉毒素對人類致癌的證據(jù)充分,所以才歸為2B類致癌物[4-5]。事實上,OTA對嚙齒動物和家禽是強(qiáng)致癌物[6]。OTA的主要靶器官是腎臟[7-8]。OTA誘導(dǎo)的腎毒性機(jī)制主要包括:抑制蛋白質(zhì)合成,干擾轉(zhuǎn)錄調(diào)控，代謝酶、細(xì)胞信號和組蛋白修飾[9],阻滯細(xì)胞周期,誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡,激活自噬[10],以及上述機(jī)制之間的相互作用[3]。

齊墩果酸(oleanolic acid,OA)是一種生物活性的五環(huán)三萜類化合物,廣泛存在于各種食品原料中,如櫻桃、木瓜、葡萄、柿子、藍(lán)莓、山楂、大棗和枇杷等。目前的研究表明OA對糖尿病性腎病、多囊腎病、腎纖維化、高血壓性腎損傷、藥物及重金屬誘導(dǎo)的腎損傷等腎損傷均有一定的保護(hù)作用[11]。

許多食物或食物成分如番茄紅素、α-生育酚、兒茶素、白藜蘆醇等對OTA的腎毒性都有一定的拮抗作用[3]。但明確有護(hù)腎作用的OA對OTA的腎毒性是否同樣有拮抗作用還未見報道,因此本文擬對OA拮抗OTA誘導(dǎo)的HEK293T細(xì)胞毒性的機(jī)制進(jìn)行初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

齊墩果酸(純度≥97%) 西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司;赭曲霉毒素A(純度≥97%) 以色列Fermentek公司;人胚腎上皮細(xì)胞(HEK293T) 來源于中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院;胎牛血清 美國Hyclone公司;DMEM(高糖)培養(yǎng)基 北京索萊寶科技有限公司;丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺 美國Amresco公司;Alpha-Tubulin抗體 武漢三鷹生物技術(shù)有限公司;Phospho-p70 S6 kinase(Thr389)抗體、Phospho-mTOR(Ser2448)抗體、Phospho-Beclin-1(Ser15)(D4B7R)抗體和LC3B(D11)XP?抗體 美國細(xì)胞信號技術(shù)中國分公司;增強(qiáng)型CCK8試劑盒、活性氧檢測試劑盒(DCFH-DA熒光探針)、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG和辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG 上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

BC-J80S二氧化碳培養(yǎng)箱 上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司;Centrifuge 5418R高速冷凍離心機(jī) 艾本德中國有限公司;Navios流式細(xì)胞儀 貝克曼庫爾特商貿(mào)(中國)有限公司;Mini-PROTEAN?Tetra垂直電泳槽、Chemi DocTMTouch化學(xué)發(fā)光成像儀 美國伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司;TP-114微量電子天平 丹佛儀器(北京)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HEK293T細(xì)胞培養(yǎng)選用DMEM完全培養(yǎng)基,內(nèi)含10%胎牛血清,1%三抗(三種抗生素包括青霉素、鏈霉素和兩性霉素B的混合物),1%非必需氨基酸,2% L-谷氨酰胺和86% DMEM(高糖)培養(yǎng)基。用0.001%多聚L-賴氨酸鋪板37 ℃孵育15 min后按2.5×104個HEK293T細(xì)胞/cm2接種,在37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.2.2 OA處理對細(xì)胞存活率的影響檢測 將1.2.1得到的細(xì)胞按1萬個細(xì)胞/孔接種于96孔板中,每孔約80%表面長滿HEK293T細(xì)胞時,給予7個不同濃度的OA(0、1、4、8、12、20和40 μmol/L)處理2 h,處理結(jié)束后重新?lián)Q上100 μL DMEM培養(yǎng)基,然后每孔加入10 μL增強(qiáng)型CCK8溶液,在培養(yǎng)箱內(nèi)37 ℃繼續(xù)孵育2 h,450 nm波長下檢測吸光度值并計算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率(%)=(處理組OD值-空白組OD值)×100/(對照組OD值-空白組OD值)?？瞻捉M不接種細(xì)胞,但加入等量DMEM培養(yǎng)基和CCK8溶液的對照組。每組處理做5個復(fù)孔的重復(fù)[1]。通過細(xì)胞存活率的檢測確定OA進(jìn)一步實驗的處理濃度。

1.2.3 OA和OTA處理對細(xì)胞存活率的影響檢測 將1.2.1得到的細(xì)胞按1萬個細(xì)胞/孔接種于96孔板中,每孔約80%表面長滿HEK293T細(xì)胞時,分6組(對照組、OTA組、OA組、P組、M組和L組)進(jìn)行給藥。其中對照組僅加100 μL DMEM培養(yǎng)基;OTA組僅加OTA處理;OA組僅加OA處理;P組為先OA處理,處理結(jié)束后用OTA處理;M組為OTA處理22 h后,用OA和OTA同時處理2 h;L組為先OTA處理,處理結(jié)束后用OA處理。每組的OTA和OA各自的處理時間和濃度如下:OTA處理HEK293T細(xì)胞的時間為24 h,OA處理HEK293T細(xì)胞的時間為2 h;OTA處理濃度為實驗室之前已經(jīng)實驗確定好的半數(shù)抑制濃度8 μmol/L[12],OA處理濃度由1.2.2的細(xì)胞存活率實驗確定。給藥結(jié)束后重新?lián)Q上100 μL DMEM培養(yǎng)基,然后每孔加入10 μL增強(qiáng)型CCK8溶液,在培養(yǎng)箱內(nèi)37 ℃繼續(xù)孵育2 h,450 nm波長下檢測吸光度值并按1.2.2方法計算細(xì)胞存活率。

1.2.4 OA和OTA處理對活性氧簇(ROS)含量的影響檢測 將1.2.1得到的細(xì)胞接種于6孔板中,每孔約80%表面長滿HEK293T細(xì)胞時,按1.2.3分組進(jìn)行處理,處理結(jié)束后吸干處理液用PBS緩沖液漂洗1次。用無血清DMEM培養(yǎng)基將DCFH-DA熒光探針稀釋1000倍,終濃度為10 μmol/L,按照每孔1 mL加入稀釋好的DCFH-DA熒光探針37 ℃孵育20 min,用無血清DMEM培養(yǎng)基洗滌3次,去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA熒光探針。以Rosup為活性氧陽性對照試劑,同樣處理獲得活性氧陽性細(xì)胞。將各組細(xì)胞制成單細(xì)胞混懸液放入流式管中,用流式細(xì)胞儀檢測活性氧水平水平。每組處理做3個復(fù)孔的重復(fù)[1]。

1.2.5 OA和OTA處理對自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響檢測 按照比例(裂解液∶PMSF∶蛋白酶抑制劑∶磷酸酶抑制)(100∶1∶2∶2)配制好裂解液后置于冰上待用。細(xì)胞按1.2.3分組處理結(jié)束后用預(yù)冷PBS緩沖液漂洗3次,吸干后每個培養(yǎng)皿加入200 μL裂解液,用細(xì)胞刮刀刮下貼壁細(xì)胞,轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的EP管中,冰上靜止30 min,12000 r/min、4 ℃離心30 min,吸取上清液得到蛋白樣本。之后按照以下步驟操作:80～120 V進(jìn)行蛋白電泳,以180 mA恒定電流電轉(zhuǎn)90 min后取出PVDF膜用5%封閉液室溫封閉1～2 h,一抗(Alpha-Tubulin、Phospho-p70 S6 kinase、Phospho-mTOR、Phospho-Beclin-1、LC3B)4 ℃孵育過夜,TBST洗膜后室溫下二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG和辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG)孵育1～2 h,洗膜后顯色,用化學(xué)發(fā)光成像儀獲取圖像,并在軟件中獲得蛋白條帶的灰度值[1]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 OA處理對細(xì)胞存活率的影響

如圖1所示,與對照組相比,低濃度的OA(1 μmol/L)能夠顯著提高細(xì)胞存活率(p<0.05),有一定的促增殖作用。隨著OA處理濃度的增加細(xì)胞存活率稍有降低,但與對照均無顯著差異(p>0.05),說明OA確實是一個生物活性成分,即使在較高濃度(40 μmol/L)下也沒有明顯的毒性。因此,選用具有生物活性的低濃度OA(1 μmol/L)作為進(jìn)一步實驗的濃度。

圖1 不同濃度OA對細(xì)胞存活率的影響Fig.1 Effects of different concentrations of OA on cell viability注:不同小寫字母代表差異顯著(p<0.05),下圖同。

2.2 OA和OTA處理對細(xì)胞存活率的影響

如圖2所示,與對照組相比,OA處理顯著增加細(xì)胞存活率(p<0.05),OTA處理顯著降低細(xì)胞存活率(p<0.05)。與OTA組相比,P組(OA預(yù)處理組)、M組(OA與OTA同時處理組)和L組(OA后處理組)細(xì)胞存活率均顯著提升(p<0.05),提示實際生活中無論哪種方式攝入含OA的食品在一定程度上能夠?qū)TA誘導(dǎo)的腎細(xì)胞毒性有一定的拮抗作用。

圖2 OA和OTA處理對細(xì)胞存活率的影響Fig.2 Effect of OA and OTA treatment on cell viability

2.3 OA和OTA處理對ROS含量的影響

如圖3所示,與對照組相比,OTA處理組顯著增加了細(xì)胞內(nèi)活性氧簇(Reactive oxygen species,ROS)含量(p<0.05),OA處理組ROS含量略有升高,但與對照組無顯著差異(p>0.05)。與OTA組相比,P組和L組ROS含量顯著降低(p<0.05),M組有降低ROS含量的趨勢,但與OTA處理組ROS含量差異不顯著(p>0.05),比P組和L組降ROS的效果稍差一點(diǎn)。但P組、M組和L組這3組之間的ROS含量無顯著差異(p>0.05),且與對照組無顯著差異(p>0.05),這提示實際生活中無論哪種方式攝入含OA的食品在一定程度上能夠?qū)TA誘導(dǎo)的ROS升高有一定的拮抗作用。

圖3 OA和OTA處理對ROS水平的影響Fig.3 Effect of OA and OTA treatment on ROS contents

2.4 OA和OTA處理對自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

如圖4所示,與對照組相比,OTA組磷酸化的哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)和磷酸化的p70S6激酶(p-p70s6k)的表達(dá)顯著降低、磷酸化的Beclin1(p-Beclin1)和LC3-II的表達(dá)顯著增加(p<0.05),OA組p-mTOR、p-p70s6k、p-Beclin1和LC3-II的表達(dá)無明顯差異(p>0.05)。與OTA組比較,L組p-mTOR和p-p70s6k表達(dá)顯著增加、p-Beclin1和LC3-II的表達(dá)顯著降低(p<0.05),M組p-Beclin1和LC3-II的表達(dá)顯著降低(p<0.05),P組p-Beclin1的表達(dá)顯著降低(p<0.05)。mTOR通過磷酸化來抑制ULK1復(fù)合物來抑制自噬。p70S6K作為mTOR磷酸化激活的下游蛋白,p70S6K(Thr389)的表達(dá)狀況也可部分反映mTOR活性。ULK1通過磷酸化Beclin1激活PI3KC3復(fù)合物1形成吞噬泡,進(jìn)而招募LC3-I共價到磷脂酰乙醇胺上轉(zhuǎn)變成LC3-II定位到吞噬泡膜上形成自噬體激活自噬,因此可以用LC3-II/LC3-I的水平來反映自噬激活情況[14]。因此,雖然1 μmol/L OA不會明顯激活或者抑制自噬,但是能不同程度緩解OTA誘導(dǎo)的HEK293T細(xì)胞自噬,L組最為顯著。

圖4 OA和OTA處理對自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effect of OA and OTA treatment on the expression of autophagy-related proteins

3 討論

ROS作為一個細(xì)胞內(nèi)信號分子參與了自噬的調(diào)節(jié)及自噬性細(xì)胞死亡,同時也受到自噬的調(diào)節(jié)[15-16]。有研究表明ROS與mTOR和自噬之間存在一定的聯(lián)系。例如,Xu等[17]報道的毛酸漿(茄科植物)提取物通過誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生來抑制mTOR從而誘導(dǎo)自噬。本實驗研究表明不同OA處理方式能夠不同程度的緩解OTA誘導(dǎo)的ROS的升高,尤其是L組(圖3),而L組對自噬的抑制也最為明顯(圖4),這與Xu等[17]所證實的結(jié)論相一致。

自噬是一個自我吞噬的體系,將包括細(xì)胞器在內(nèi)的一些細(xì)胞組分包裹進(jìn)一個叫做自噬體的雙層膜結(jié)構(gòu),然后與溶酶體融合,被溶酶體內(nèi)的水解酶降解[18]。胞內(nèi)外應(yīng)激、饑餓信號、生長因子剝奪、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、致病菌感染及損傷的細(xì)胞器或蛋白質(zhì)聚集積累等都會誘導(dǎo)自噬來維持細(xì)胞在不利環(huán)境中的生存,此時自噬作為一種細(xì)胞生存的保護(hù)機(jī)制,當(dāng)發(fā)生過度自噬時,細(xì)胞發(fā)生自噬性細(xì)胞死亡[19]。自噬不足或者過度都會導(dǎo)致細(xì)胞損傷,恰當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)自噬對細(xì)胞健康是必要的。自噬被上游信號級聯(lián)網(wǎng)絡(luò)嚴(yán)格控制,其中mTOR已被確定為自噬的關(guān)鍵負(fù)調(diào)節(jié)因子[20]。圖4觀察到OTA通過下調(diào)p-mTOR、p-p70S6K的表達(dá),上調(diào)p-Beclin1、LC3-II的表達(dá)來誘導(dǎo)自噬。結(jié)合圖2來看,OTA激活了自噬但是并沒有導(dǎo)致細(xì)胞存活率增加,反而導(dǎo)致了更多細(xì)胞的死亡,這就說明OTA誘導(dǎo)的自噬屬于過度自噬,引起的細(xì)胞的自噬性死亡。因此,結(jié)合圖2～圖4可以說明,雖然1 μmol/L OA不會明顯誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生和激活自噬,但是能夠通過調(diào)節(jié)p-mTOR、p-p70S6K、p-Beclin1和LC3的表達(dá)來不同程度緩解OTA誘導(dǎo)的HEK293T細(xì)胞的自噬性死亡,L組最為顯著。所以,人們通過攝入含OA的食品或多或少都能夠?qū)TA誘導(dǎo)的腎細(xì)胞毒性有一定的拮抗作用。

4 結(jié)論

1 μmol/L OA不會明顯誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生和激活自噬(p>0.05),但是能夠通過調(diào)節(jié)p-mTOR、p-p70S6K、p-Beclin1和LC3的表達(dá)來不同程度緩解OTA誘導(dǎo)的HEK293T細(xì)胞的自噬性死亡,OA后處理方式效果最為明顯(p<0.05)。所以,人們通過攝入含OA的食品能夠?qū)TA誘導(dǎo)的腎細(xì)胞毒性有一定的拮抗作用。