三種獼猴桃酒發(fā)酵過(guò)程中揮發(fā)性香氣成分的變化

,,王文

(西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,四川成都 610041)

獼猴桃(ActinidiachinensisPlanch)為獼猴桃科(Actinidiaceae)獼猴桃屬(Actinidia)藤本植物的肉質(zhì)果實(shí),俗稱陽(yáng)桃、羊桃、藤梨、獼猴梨等,主要分布于我國(guó)的四川省、湖北省、湖南省以及陜西省一帶[1]。按最新分類方法,目前獼猴桃屬有54個(gè)種和21個(gè)變種,其中分布于我國(guó)的種有52個(gè),可見(jiàn)我國(guó)獼猴桃種質(zhì)資源極為豐富[2]。我國(guó)種植的獼猴桃品種按照成熟果實(shí)的果肉顏色類型來(lái)看,綠肉品種居多,占總產(chǎn)量的75.3%,黃肉品種和紅心品種偏少,分別占7.7%和8.1%[3]。祝以偉等[4]和郭秀蘭等[5]對(duì)黃肉、紅心和綠肉三種獼猴桃的基本營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)行了分析與比較,三種獼猴桃的基本成分存在明顯差異。

獼猴桃屬于典型的呼吸躍變型果實(shí),采后極易腐爛,除鮮銷之外,充分開(kāi)發(fā)利用獼猴桃資源對(duì)提高獼猴桃經(jīng)濟(jì)價(jià)值有著重要的現(xiàn)實(shí)意義[6]。采用釀造果酒的方法對(duì)獼猴桃進(jìn)行深度加工制作獼猴桃果酒,是近年來(lái)獼猴桃相關(guān)產(chǎn)品開(kāi)發(fā)的主要方向[7-8]。香氣是評(píng)價(jià)獼猴桃果實(shí)及其果酒內(nèi)在品質(zhì)的重要指標(biāo),香氣的風(fēng)格和特點(diǎn)影響著獼猴桃果酒的風(fēng)味品質(zhì)和消費(fèi)者的選購(gòu)心理。Soufleros等[9]對(duì)產(chǎn)自希臘的獼猴桃發(fā)酵酒的糖、酸、酒精度和揮發(fā)性風(fēng)味成分等進(jìn)行了定量分析和感官評(píng)價(jià)。Li等[10]采用主成分分析法分析揮發(fā)性風(fēng)味成分,能將六種商業(yè)化酵母菌株發(fā)酵的獼猴桃酒的風(fēng)味特征較好地區(qū)分開(kāi)。陳亮等[11]對(duì)普通獼猴桃、紅心獼猴桃和野生軟棗獼猴桃發(fā)酵酒的香氣成分進(jìn)行了鑒定與分析,得出了每種獼猴桃酒的主要香氣成分。目前,關(guān)于不同品種獼猴桃發(fā)酵酒的香氣成分差異的報(bào)道較少,獼猴桃酒在發(fā)酵過(guò)程中香氣成分的變化規(guī)律更未見(jiàn)報(bào)道。

“金艷”獼猴桃是全球三大優(yōu)良黃肉獼猴桃品種之一,是1984年由中國(guó)科學(xué)院武漢植物園利用中華獼猴桃和毛華獼猴桃進(jìn)行種間雜交選育而成,果肉金黃色、細(xì)嫩多汁、香甜可口[12]?！凹t陽(yáng)”獼猴桃是四川省“八五”育種攻關(guān)期間從四川蒼溪縣野生紅心獼猴桃中選育出的世界首個(gè)紅心型新品種,果心橫截面呈放射狀紅色條紋形似太陽(yáng),色彩鮮美,果汁豐富,酸甜適中,清香爽口[13]?！懊琢?號(hào)”獼猴桃是湖南吉首大學(xué)在湘西米良鄉(xiāng)美味獼猴桃中選育出來(lái)的優(yōu)良綠肉品種,汁多、甜酸適度、肉質(zhì)鮮嫩、具有清香味[14]。本研究以金艷、紅陽(yáng)和米良1號(hào)三種分別代表黃肉、紅心和綠肉類型的獼猴桃為原料,在相同發(fā)酵工藝條件下,采用頂空固相微萃取/氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測(cè)定前發(fā)酵結(jié)束時(shí)、后發(fā)酵中期和后發(fā)酵結(jié)束時(shí)三種獼猴桃酒的揮發(fā)性香氣成分,為研究不同獼猴桃果實(shí)品種對(duì)發(fā)酵酒風(fēng)味品質(zhì)的影響以及探明獼猴桃酒風(fēng)味品質(zhì)形成規(guī)律提供科學(xué)依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金艷獼猴桃(黃肉)、紅陽(yáng)獼猴桃(紅心) 取自四川省蒲江縣;米良一號(hào)獼猴桃(綠肉) 取自湖北省宜昌市。獼猴桃果實(shí)約八九成熟,初始糖度分別為紅陽(yáng)獼猴桃16 °Brix左右,金艷獼猴桃13 °Brix左右,米良一號(hào)獼猴桃11 °Brix左右,初始酸度分別為紅陽(yáng)獼猴桃10～11 g/L,金艷獼猴桃10～11 g/L,米良一號(hào)獼猴桃12～13 g/L(果汁酸度以檸檬酸計(jì));安琪葡萄酒、果酒專用酵母SY 購(gòu)自湖北省安琪酵母股份有限公司;偏重亞硫酸鉀、果膠酶 煙臺(tái)曼森公司;白砂糖 市售;環(huán)己酮(GC級(jí)) 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;其他試劑 均為分析純。

JS30-230多功能攪拌機(jī) 蘇泊爾股份有限公司;隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱 寧波市機(jī)電工業(yè)研究設(shè)計(jì)院;PL-303電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;Thermos氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀,配置Triplus進(jìn)樣系統(tǒng),具備頂空固相微萃取方式 美國(guó)Thermos公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 獼猴桃酒發(fā)酵工藝流程

操作要點(diǎn):挑選八、九成熟的獼猴桃果實(shí),洗凈后去皮打漿,以80 mg/L SO2量計(jì)添加偏重亞硫酸鉀。按40 mg/L向果漿中添加果膠酶,在40 ℃水浴中酶解2 h,然后用4層紗布過(guò)濾,得到獼猴桃濁汁,果汁pH為3.2～3.7,添加白砂糖調(diào)整初始糖度至22 °Brix。按照0.4 g/L的接種量加入活性干酵母,28 ℃下進(jìn)行前發(fā)酵5 d,當(dāng)還原糖含量降至12 g/L以下,去渣分離,得到原酒。原酒在18 ℃下進(jìn)行后發(fā)酵14 d,還原糖含量降至4.0 g/L以下結(jié)束發(fā)酵。

1.2.2 獼猴桃酒香氣成分的測(cè)定

1.2.2.1 獼猴桃酒香氣成分的提取 取5 mL樣品置于20 mL樣品瓶中,加入1.0 g NaCl促進(jìn)揮發(fā)性成分的揮發(fā),加入3 μL環(huán)己酮,加蓋密封,采用老化好的50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭插進(jìn)樣品瓶,在60 ℃條件下,預(yù)孵化10 min,萃取30 min后拔出,將萃取針插入氣相色譜儀進(jìn)樣口,于230 ℃解析2 min。

1.2.2.2 GC-MS條件 氣相色譜條件:HP-5MS色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);不分流模式,不分流1 min之后分流比為50∶1;流速1 mL/min;升溫程序:40 ℃保持3 min,以6 ℃/min升溫至180 ℃并保持2 min,再以10 ℃/min升溫至230 ℃并保持6 min;載氣為99.999%氦氣;進(jìn)樣口溫度230 ℃;解析時(shí)間2 min。

質(zhì)譜條件:電離方式為電子電離源,電子能量70 eV,離子源溫度250 ℃,傳輸線溫度280 ℃,采集模式為全掃描模式,質(zhì)量掃描范圍33～350 amu。

1.2.2.3 香氣成分的定性定量分析 運(yùn)用NIST數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)結(jié)果進(jìn)行初步檢索及資料分析,再結(jié)合人工譜圖解析,定性確定各種組分。定量采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行半定量分析,以環(huán)己酮作為內(nèi)標(biāo)物[15]。計(jì)算公式為:

各香氣成分的含量(μL/L)=(各組分的峰面積×內(nèi)標(biāo)物體積(μL))/內(nèi)標(biāo)物峰面積×樣品量(L)

1.3 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 18.0進(jìn)行差異顯著性分析。組內(nèi)比較采用單因素方差分析,組間差異性分析采用Duncan法,以p<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)意義標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 三種獼猴桃發(fā)酵酒揮發(fā)性香氣成分的測(cè)定結(jié)果

從表1可以看出,三種獼猴桃發(fā)酵原汁僅檢測(cè)出低含量的乙醇、乙酸乙酯、丁酸乙酯和苯甲酸甲酯,金艷發(fā)酵原汁多檢出了己酸乙酯和辛酸乙酯。發(fā)酵過(guò)程中獼猴桃酒的24種主要香氣組分包括17種酯類、5種醇類和2種酸類物質(zhì),三種獼猴桃酒之間香氣種類差別很小,但含量存在明顯差異。發(fā)酵5 d時(shí),三個(gè)品種的乙醇含量顯著(p<0.05)增加,還新產(chǎn)生了異丁醇、異戊醇和苯乙醇。紅陽(yáng)產(chǎn)生的異丁醇和異戊醇含量高,米良一號(hào)產(chǎn)生的異戊醇和苯乙醇含量高,相比之下金艷產(chǎn)生的異丁醇、異戊醇和苯乙醇含量偏低。經(jīng)過(guò)5 d的前發(fā)酵過(guò)程,紅陽(yáng)和金艷的丁酸乙酯、金艷的己酸乙酯相比原汁沒(méi)有顯著變化(p>0.05),紅陽(yáng)和米良一號(hào)的苯甲酸甲酯顯著低于發(fā)酵原汁(p<0.05)以外,紅陽(yáng)產(chǎn)生了13種新的酯類物質(zhì),金艷產(chǎn)生了12種新的酯類物質(zhì),米良一號(hào)產(chǎn)生了13種新的酯類物質(zhì),并且金艷產(chǎn)生的各種酯類物質(zhì)含量都顯著高于紅陽(yáng)和米良一號(hào)(p<0.05)。三個(gè)品種新產(chǎn)生了辛酸,米良一號(hào)還多產(chǎn)生了癸酸。表明在前發(fā)酵5 d過(guò)程中,在酵母菌的發(fā)酵作用下,發(fā)酵原汁中的風(fēng)味前體物質(zhì)轉(zhuǎn)化成了各種豐富的揮發(fā)性香氣成分。

表1 三種獼猴桃發(fā)酵酒中揮發(fā)性香氣組分的GC-MS分析結(jié)果(μL/L)Table 1 Results of volatile aroma components from three kiwifruit wines by GC-MS(μL/L)

續(xù)表

續(xù)表

發(fā)酵12 d時(shí),三個(gè)品種的乙醇、異丁醇和異戊醇含量都有降低,除米良一號(hào)的苯乙醇幾乎沒(méi)有變化以外,金艷和紅陽(yáng)的苯乙醇含量也有降低。酯類物質(zhì)中除紅陽(yáng)的辛酸乙酯和癸酸乙酯以及米良一號(hào)的癸酸乙酯含量有一定增加以外,其他酯類物質(zhì)的含量都有所降低或變化不明顯,金艷產(chǎn)生的各種酯類物質(zhì)含量仍顯著高于紅陽(yáng)和米良一號(hào)(p<0.05)。三個(gè)品種的辛酸和癸酸含量也有下降。表明在后發(fā)酵過(guò)程中(發(fā)酵第5～12 d),各種揮發(fā)性成分含量呈現(xiàn)降低趨勢(shì),相比前發(fā)酵剛結(jié)束時(shí)(發(fā)酵第5 d)總體的香氣減弱。

發(fā)酵19 d時(shí),三個(gè)品種的乙醇含量回升至發(fā)酵5 d時(shí)的水平,金艷的苯乙醇和紅陽(yáng)的壬酸乙酯含量有顯著增加(p<0.05),其他的醇類、酯類和酸類物質(zhì)均進(jìn)一步降低或變化不明顯,說(shuō)明在后發(fā)酵過(guò)程中(發(fā)酵第12～19 d),總體的香氣繼續(xù)減弱并逐漸趨于穩(wěn)定。

2.2 三種獼猴桃發(fā)酵酒香氣成分的主成分分析

由表2可以看出,以獼猴桃果酒的24種香氣組分作為變量進(jìn)行主成分分析,根據(jù)特征根大于1的原則提取了4個(gè)主成分因子,包含了原始變量91.243%的信息。從主成分因子載荷矩陣表3中可以看出,24個(gè)變量在4個(gè)主成分上的載荷系數(shù)大小,即其對(duì)主成分的貢獻(xiàn)率大小。主成分因子1反映15個(gè)酯類(除棕櫚酸乙酯和壬酸乙酯以外的其余酯類)和辛酸的信息,主成分因子2反映苯乙醇、異丙醇、棕櫚酸乙酯和癸酸的信息,主成分因子3反映了異丁醇和異戊醇的信息,主成分因子4則體現(xiàn)了乙醇和壬酸乙酯的信息。

表3 主成分因子載荷矩陣Table 3 Principal component factor load matrix

表2 總方差解釋Table 2 Total variance explanation

如表4所示,第一主成分包括絕大部分酯類物質(zhì),乙酸乙酯呈甜果香,乙酸異戊酯有香蕉香,辛酸乙酯有菠蘿、梨和花香,癸酸乙酯具有水果香氣,月桂酸乙酯具有花香和果香氣味,己酸乙酯具有青蘋(píng)果香和花香,丁酸乙酯具有草莓、香蕉香,辛酸異戊酯有水果香味,乙酸苯乙酯具有令人愉悅的茉莉花香[16-17],因此第一主成分可以體現(xiàn)獼猴桃酒的花香和果香氣息。在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中,紅陽(yáng)獼猴桃酒在發(fā)酵5 d(301.29 μL/L)和12 d(301.58 μL/L)時(shí)第一主成分含量都很高且相近,發(fā)酵19 d(192.06 μL/L)時(shí)第一主成分含量大幅下降;同樣,米良一號(hào)獼猴酒在發(fā)酵5 d(210.77 μL/L)和12 d(231.52 μL/L)時(shí)第一主成分含量均較高,發(fā)酵19 d(142.68 μL/L)時(shí)第一主成分含量明顯下降;金艷獼猴桃酒伴隨發(fā)酵進(jìn)程第一主成分含量不斷降低。可見(jiàn),紅陽(yáng)和米良一號(hào)獼猴桃酒的果香和花香形成于發(fā)酵12 d內(nèi),在進(jìn)一步的后發(fā)酵期中果香和花香明顯減弱;金艷獼猴桃酒的果香和花香則形成于發(fā)酵5 d內(nèi),在后發(fā)酵期內(nèi)果香和花香遞減。并且,在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中酯類物質(zhì)總含量為金艷獼猴桃酒>紅陽(yáng)獼猴桃酒>米良一號(hào)獼猴桃酒。

表4 三種獼猴桃酒發(fā)酵過(guò)程中主成分含量變化(μL/L)Table 4 The variation of principal component contents from three cultivars of kiwifruit wines during fermentation process(μL/L)

在第二主成分的四個(gè)組分中苯乙醇和癸酸是主要貢獻(xiàn)組分。苯乙醇賦予獼猴桃酒玫瑰花香,在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中,米良一號(hào)獼猴桃酒的苯乙醇含量明顯高于紅陽(yáng)和金艷獼猴桃酒,具有更為突出的玫瑰花香;紅陽(yáng)、金艷和米良一號(hào)獼猴桃酒的苯乙醇含量分別在發(fā)酵5、19、12 d時(shí)達(dá)到最高。三種獼猴桃果酒中只有米良一號(hào)獼猴桃酒檢測(cè)出癸酸,高級(jí)脂肪酸一般具有脂肪、奶酪味道,對(duì)酒有腐臭、刺激的負(fù)向貢獻(xiàn)。第三主成分包括異丁醇和異戊醇兩組分,體現(xiàn)了獼猴桃酒的高級(jí)醇含量。三種獼猴桃酒的第三主成分含量都是在發(fā)酵5 d時(shí)達(dá)到最高值,發(fā)酵12 d時(shí)含量大幅降低,發(fā)酵19 d時(shí)含量變化不明顯。表明三種獼猴桃酒的高級(jí)醇都是在前發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生,前發(fā)酵結(jié)束時(shí)含量升至最高,后發(fā)酵過(guò)程中含量不斷降低并趨于穩(wěn)定。并且,在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中,紅陽(yáng)和米良一號(hào)獼猴桃酒的高級(jí)醇含量高于金艷獼猴桃酒。第四主成分中乙醇是主要貢獻(xiàn)組分,其構(gòu)成獼猴桃酒的酒香。三種獼猴桃酒在發(fā)酵過(guò)程中乙醇含量變化呈現(xiàn)相同趨勢(shì),發(fā)酵5 d時(shí)乙醇含量達(dá)到較高水平,發(fā)酵12 d時(shí)乙醇含量有小幅降低,發(fā)酵19 d時(shí)乙醇含量回升至發(fā)酵5 d時(shí)的水平。

3 討論與結(jié)論

高級(jí)醇又稱雜醇油,是酵母菌酒精發(fā)酵的正常副產(chǎn)物,主要由正丙醇、異丁醇(2-甲基-1-丙醇)、活性戊醇(2-甲基-1-丁醇)和異戊醇(3-甲基-1-丁醇)組成。適量的高級(jí)醇促使酒類具有豐滿的香氣和口味,增加酒的協(xié)調(diào)性,賦予酒醇厚感。但含量過(guò)高時(shí)將會(huì)使酒產(chǎn)生異味,如苦味、汗臭味和腐敗味等,嚴(yán)重影響酒的質(zhì)量與風(fēng)味[18]。本研究從三種獼猴桃發(fā)酵酒中僅檢出異丁醇和異戊醇,據(jù)報(bào)道這兩種醇也正是酒中主要的高級(jí)醇,用這兩種醇足以評(píng)價(jià)高級(jí)醇對(duì)酒風(fēng)味的影響[19]。魏運(yùn)平[20]報(bào)道,采用不同品種的獼猴桃進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)生的高級(jí)醇含量差別明顯。本研究結(jié)果得出,在發(fā)酵第5、12、19 d時(shí),紅陽(yáng)和米良一號(hào)獼猴桃酒的高級(jí)醇含量均高于金艷獼猴桃酒,紅陽(yáng)和米良一號(hào)獼猴桃酒之間也存在一定差異。魏運(yùn)平和本研究結(jié)果說(shuō)明獼猴桃品種對(duì)獼猴桃酒的高級(jí)醇含量有直接影響。

李華等[21]、劉樹(shù)文等[22]和郭靜等[23]都對(duì)獼猴酒的揮發(fā)性香氣成分進(jìn)行了定性鑒定與分析,Soufleros等[9]還對(duì)希臘獼猴酒的香氣成分進(jìn)行了研究。本研究對(duì)發(fā)酵結(jié)束后的獼猴桃酒香氣成分進(jìn)行分析,運(yùn)用內(nèi)標(biāo)法對(duì)醇類、酯類和酸類24個(gè)香氣成分進(jìn)行相對(duì)定量分析,得出的主要香氣成分與李華、劉樹(shù)文、郭靜和Soufleros等報(bào)道的物質(zhì)有相同之處,都檢出了異丁醇、苯乙醇、乙酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸異戊酯等重要揮發(fā)性香氣成分。然而,李華、劉樹(shù)文、Soufleros和本研究都從獼猴桃酒中檢出相對(duì)含量較高的異戊醇,而郭靜等沒(méi)有檢出異戊醇而檢出活性戊醇;本研究檢出相對(duì)含量較高的辛酸和癸酸與郭靜等報(bào)道一致,沒(méi)有檢出李華和劉樹(shù)文等報(bào)道的己酸,也沒(méi)有檢出Soufleros報(bào)道的丁酸和異丁酸。郭靜和本研究采用了頂空固相微萃取法,郭靜使用非極性PDMS萃取頭,本研究使用的是中等極性DVB/CAR/PDMS萃取頭,李華和劉樹(shù)文等采用了溶劑萃取法,Soufleros采用的是直接進(jìn)樣法。可見(jiàn),不同的香氣成分提取方式可能是造成檢出物質(zhì)差異的原因之一。

本文對(duì)三個(gè)品種獼猴桃在酵母菌發(fā)酵過(guò)程中形成的香氣成分進(jìn)行了相對(duì)定量分析,檢出24種主要的香氣成分,發(fā)現(xiàn)前發(fā)酵后金艷獼猴桃酒的酯類物質(zhì)含量顯著高于紅陽(yáng)和米良一號(hào)獼猴桃酒,后發(fā)酵過(guò)程中酯類物質(zhì)含量有所降低但金艷獼猴桃酒的酯類含量仍高于紅陽(yáng)和米良一號(hào)獼猴桃酒,表現(xiàn)為發(fā)酵過(guò)程中金艷獼猴桃酒的乙酸乙酯、乙酸異戊酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、己酸乙酯和丁酸乙酯等含量均明顯高于紅陽(yáng)和米良一號(hào)獼猴桃酒。在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中米良一號(hào)獼猴桃酒的苯乙醇含量明顯高于其他兩種,具有更為突出的玫瑰花香;紅陽(yáng)、金艷和米良一號(hào)獼猴桃酒的苯乙醇含量分別在發(fā)酵5、19、12 d時(shí)達(dá)到最高。米良一號(hào)和紅陽(yáng)獼猴桃酒的高級(jí)醇含量明顯高于金艷獼猴桃酒,米良一號(hào)和金艷獼猴桃酒的乙醇含量略高于紅陽(yáng)獼猴桃酒,醇類物質(zhì)含量均在前發(fā)酵結(jié)束時(shí)升至最高,后發(fā)酵階段醇類物質(zhì)含量逐漸降低并趨于穩(wěn)定。