熱壓結(jié)合處理對低溫火腿中耐壓腐敗菌的抑制作用

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(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)肉品加工與質(zhì)量控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇省肉類生產(chǎn)與加工質(zhì)量安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇南京 210095; 2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,江蘇南京 210014; 3.江蘇雨潤肉食品有限公司,肉品加工與質(zhì)量控制國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇南京 211806)

低溫肉制品是指在常壓下通過蒸、煮、熏、烤等熱加工過程使肉制品的中心溫度控制在68～72 ℃,并且需要在0～4 ℃的低溫環(huán)境下貯藏、運(yùn)輸及銷售的一類肉制品[1]。其中,低溫火腿因其營養(yǎng)豐富、味道鮮嫩等特點(diǎn),深受消費(fèi)者的喜愛,但其加工溫度較低可能會導(dǎo)致殺菌不徹底,嚴(yán)重影響該類產(chǎn)品的貨架期,制約低溫火腿產(chǎn)品的發(fā)展[2]。

研究表明,使用超高壓技術(shù)可以使低溫火腿產(chǎn)品中大部分初始腐敗微生物[3]失去活性,但是也存在一些耐壓菌如腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)和綠色魏斯菌(Weissellaviridescens)等[4],這兩種菌普遍存在于低溫肉制品中[5],且具有抵抗外界很多不利條件的能力,例如耐有機(jī)酸、乳酸鏈球菌素等。熱壓結(jié)合處理滅菌(High pressure thermal sterilization treatment,HPTS)是熱處理協(xié)同超高壓處理技術(shù),既可以降低超高壓處理的壓力和時間[6],又能有效保護(hù)肉品營養(yǎng)價值和其質(zhì)構(gòu)特性[7]。研究證明,HPTS技術(shù)可以有效滅菌[8]和滅活芽孢[9-10],實(shí)際生產(chǎn)中多應(yīng)用于殺滅牛奶、飲料等中的芽孢菌,在肉制品領(lǐng)域的研究仍有待深入。

本文以低溫火腿中最主要的兩個耐壓腐敗菌——綠色魏斯菌和腸膜明串珠菌為研究對象,采用掃描電鏡(SEM)和透射電鏡(TEM)和流式細(xì)胞技術(shù)(FCM)研究經(jīng)熱壓結(jié)合處理(處理?xiàng)l件參照文獻(xiàn)[11])的細(xì)胞形態(tài)、內(nèi)部結(jié)構(gòu)和細(xì)胞生理狀態(tài)的變化,同時結(jié)合核酸、蛋白質(zhì)流失探究細(xì)胞膜的完整性的破壞,從而探討熱壓結(jié)合處理對綠色魏斯菌和腸膜明串珠菌的細(xì)胞膜的影響,旨在為熱壓結(jié)合處理應(yīng)用于肉品殺菌提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

綠色魏斯菌(GU458345)、腸膜明串珠菌(GU458344) 江蘇雨潤肉食品有限公司肉品加工與質(zhì)量控制國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏;MRS肉湯培養(yǎng)基(MRS Broth):蛋白胨10.0 g/L,牛肉粉 8.0 g/L,酵母粉4.0 g/L,葡萄糖 20.0 g/L,磷酸氫二鉀 2.0 g/L,檸檬酸氫二銨 2.0 g/L,乙酸鈉 5.0 g/L,硫酸鎂 0.2 g/L,硫酸錳 0.04 g/L,吐溫80 1.0 g/L;平板計數(shù)瓊脂(PCA):胰蛋白胨 5.0 g/L,酵母浸粉 2.5 g/L,葡萄糖1.0 g/L,瓊脂15.0 g/L;1,2-丙二醇(分析純) 上海泰坦科技股份有限公司;LIVE/DEAD? BacLight細(xì)菌細(xì)胞活性測定試劑盒(LIVE/DEAD? BacLight Bacterial Viability Kits) 美國英韋創(chuàng)津公司。

SPF-S-1L-100-850-9-W 型超高壓處理裝置 英國Stansted Fluid Power公司;AUY120型電子分析天平 日本SHIMADZU公司;MUL-9000系列純水機(jī) 美國密理博公司;M2e多功能酶標(biāo)儀 德國MD公司;Hitachi SU8010冷場發(fā)射掃描電鏡 日本日立公司;H-7650透射電子顯微鏡 日本日立公司;Accuri C6流式細(xì)胞儀 美國BD公司;Bioscreen C FP1100-C全自動細(xì)菌生長記錄儀 芬蘭Bioscreen公司;Scan1200自動影像分析菌落計數(shù)器 法國Interscience公司;NanoDrop 2000微量紫外分光計 美國Thermo公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌懸液的制備 無菌挑取凍存于-80 ℃的菌種,接種于新鮮的MRS肉湯培養(yǎng)基中,30 ℃培養(yǎng)活化,重復(fù)以上步驟進(jìn)行第2次活化之后,收集培養(yǎng)至穩(wěn)定期的菌體,6000 r/min、4 ℃條件下離心2 min,棄除上清液,用生理鹽水重復(fù)離心洗滌菌體沉淀3次,最后制成109CFU/mL菌懸液,一部分封裝于無菌的包裝袋中熱封口,4 ℃條件冷藏以備熱壓結(jié)合處理;另一部分收集至無菌的離心管中,4 ℃冷藏。

1.2.2 熱壓結(jié)合處理 將裝有菌懸液的包裝袋置于超高壓加壓釜中,放入超高壓儀器中[12],處理壓力為350 MPa,保壓處理10 min(處理時間不包括升壓和卸壓所需時間),處理介質(zhì)為丙二醇,溫度為50 ℃,每個樣品做3次平行。

1.2.3 微生物計數(shù)

1.2.3.1 計數(shù)方法 將經(jīng)過1.2.2熱壓結(jié)合處理后的菌懸液,各處理樣(兩重復(fù))無菌取樣1 mL進(jìn)行梯度稀釋,選擇合適的稀釋度,采用平板涂布計數(shù)法進(jìn)行菌落總數(shù)的測定。未處理樣品用MRS培養(yǎng)基,熱壓結(jié)合處理后樣品采用薄層平板(TAL)計數(shù)。

TAL平板制備:在無菌平板上事先倒入約25 mL MRS瓊脂培養(yǎng)基,待培養(yǎng)基冷卻后,再向凝固的MRS培養(yǎng)基表面小心倒入約14 mL的PCA培養(yǎng)基,紫外燈下待凝固備用。

1.2.3.2 細(xì)菌的存活率計算 存活率=lg(N/N0),其中N0和N分別代表處理前和處理后的菌落數(shù)(CFU/mL)[13]。

1.2.4 熱壓結(jié)合處理前后的生長曲線的測量 吸取200 μL經(jīng)過1.2.2熱壓結(jié)合處理的菌懸液于蜂窩板內(nèi),初始濃度為2%,每組設(shè)置3個平行孔。置于30 ℃下培養(yǎng)。將蜂窩板置于全自動細(xì)菌生長記錄儀中,設(shè)置從0 h開始,每隔2 h測一次OD600值[14]。對照組為初始濃度為2%的未經(jīng)過處理的菌懸液,以MRS培養(yǎng)基為空白。

1.2.5 掃描電鏡和對細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察 將經(jīng)過1.2.2熱壓結(jié)合處理的菌懸液,6000 r/min、4 ℃離心2 min收集菌體,加入1 mL預(yù)冷的2.5%的戊二醛溶液,4 ℃條件下固定8 h以上,磷酸緩沖液(PBS,pH=7.4)漂洗3次,每次30 min,再依次經(jīng)30%、50%、70%和90%的乙醇梯度脫水各15 min后,再用100%的乙醇脫水兩次,每次15 min[15]。脫水后樣品用叔丁醇置換3次,每次30 min,置換后的樣品進(jìn)行冷凍干燥(溫度為-80 ℃，真空度為0.1 mbar),離子濺射儀鍍金(厚度約10 nm),掃描電鏡觀察菌體結(jié)構(gòu)變化,對照組為未處理的菌懸液。

1.2.6 透射電鏡對細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的觀察 將經(jīng)過1.2.2熱壓結(jié)合處理的菌懸液,6000 r/min、4 ℃離心2 min收集菌體,加入1 mL左右預(yù)冷的2.5%戊二醛溶液,4 ℃條件下固定8 h以上。固定后室溫下800 r/min離心30 s,棄上清液,加入40 ℃左右的1%瓊脂,迅速攪拌后室溫下800 r/min離心30 s冷卻成團(tuán),前部含樣品瓊脂切成小塊再加入戊二醛固定,再以PBS(pH=7.2的0.2 mol/25 L磷酸緩沖液)重懸浮,重復(fù)3次,最后以PBS重懸。分別用30%、50%、70%、80%、90%梯度濃度酒精脫水,再用純酒精脫水3次,然后用純叔丁醇置換酒精3次,每個步驟各15 min。置換后的樣品進(jìn)行冷凍干燥(溫度為-80 ℃，真空度為0.1 mbar),最后將冷凍干燥后的樣品離子電流鍍金,在透射電鏡下觀察并拍照[16-17]。設(shè)置對照組為未處理的菌懸液。

1.2.7 流式細(xì)胞儀分析 本研究利用SYTO9/PI染料(LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit,Invitrogen)對所收集的細(xì)菌細(xì)胞進(jìn)行染色,后利用流式細(xì)胞儀分析細(xì)菌細(xì)胞的死亡、受損及活細(xì)胞的比例。

將制備好的菌懸液經(jīng)過1.2.2熱壓結(jié)合處理,6000 r/min、4 ℃條件下,離心2 min收集菌體,生理鹽水洗脫3次后,加入SYTO9/PI染液(3 μL,比例為1∶1),室溫下,避光孵育15 min[18-19],上機(jī)檢測,檢測激發(fā)光為488 nm,SYTO9染料為FL1檢測通道,PI為FL3檢測通道,計數(shù)10000個細(xì)胞。將100 ℃處理30 min的樣品作為PI陽性對照,未經(jīng)過處理的樣品作為SYTO9陽性對照。

1.2.9 熱壓結(jié)合處理后細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)泄漏量的測定 將經(jīng)過1.2.2熱壓結(jié)合處理的菌懸液于4 ℃、4000 r/min離心15 min,收集上清液,使用微量分光光度計測定260 nm(核酸)和280 nm(蛋白質(zhì))處的吸光值[20-21],每組設(shè)置3個平行,對照組為未處理的菌懸液,空白為生理鹽水。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用SAS 8.0進(jìn)行成組t檢驗(yàn)(p<0.05),數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用Excel 2016進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 熱壓結(jié)合處理對兩種耐壓菌存活率的影響

通過測量兩種菌的存活率來探究熱壓結(jié)合殺菌的效果。由表1可以看出熱壓處理后綠色魏斯菌和腸膜明串珠菌的存活率為-4.74和-6.61lg(CFU/mL),綠色魏斯菌的存活率略高于腸膜明串珠菌,說明熱壓結(jié)合處理雖不能達(dá)到完全殺菌的效果,但能夠有效降低這兩種菌的存活率,可以起到抑制細(xì)菌的作用。由于微生物經(jīng)受不利條件(超高靜壓、凍融、熱處理、超聲波、輻照、微波等)后存在損傷修復(fù)現(xiàn)象,這種受傷狀態(tài)的微生物以傳統(tǒng)培養(yǎng)方法無法檢測,針對這種情況,采用薄層平板培養(yǎng)方法(thin agar layer,TAL)[22]能較為準(zhǔn)確計數(shù),在流式細(xì)胞技術(shù)結(jié)果中顯示存在損傷細(xì)胞,因此測定經(jīng)過熱壓結(jié)合處理后的菌落總數(shù)使用TAL培養(yǎng)基。

表1 經(jīng)過熱壓結(jié)合處理后綠色魏斯菌和腸膜明串珠菌的存活率Table 1 Survival rate of Weissella viridescensand Leuconostoc mesenteroides under HPTS treatment

2.2 熱壓結(jié)合處理對兩種菌的生長特性的影響

通過測量兩種菌熱壓結(jié)合處理前后的生長曲線研究細(xì)胞的生長情況。經(jīng)熱壓結(jié)合處理后,兩種菌的生長曲線如圖1所示。圖1A中,綠色魏斯菌正常菌株在0 h后進(jìn)入對數(shù)期,在18 h后進(jìn)入穩(wěn)定期,OD600值為1.246;熱壓結(jié)合處理后細(xì)菌在4 h后進(jìn)入對數(shù)期,在第24 h達(dá)到穩(wěn)定期,細(xì)菌OD600值達(dá)到1.235。圖1B中,腸膜明串珠菌正常菌株在0 h后進(jìn)入對數(shù)期,第14 h后進(jìn)入穩(wěn)定期,OD600值為1.28;熱壓結(jié)合處理后細(xì)菌從16 h后進(jìn)入對數(shù)期,在第38 h達(dá)到穩(wěn)定期,細(xì)菌OD600值達(dá)到1.289。

圖1 熱壓處理前后綠色魏斯菌和腸膜明串珠菌的生長曲線Fig.1 Growth curve of Weissella viridescensand Leuconostoc mesenteroides untreated and treated by HPTS注:A為綠色魏斯菌,B為腸膜明串珠菌。

兩種耐壓菌在熱壓結(jié)合處理后都停止了生長繁殖,經(jīng)歷了一段時間的復(fù)蘇才能正常進(jìn)行增殖,綠色魏斯菌的遲緩期變?yōu)? h,腸膜明串珠菌的遲緩期變?yōu)?6 h,且經(jīng)過復(fù)蘇后,受損細(xì)胞的生長曲線與正常細(xì)菌的相近。熱壓處理后的綠色魏斯菌和腸膜明串珠菌在對數(shù)期的生長速率略低于正常細(xì)菌,因此達(dá)到穩(wěn)定期的時間變長,綠色魏斯菌整個對數(shù)期的時長從18 h變成20 h,腸膜明串珠菌從14 h變成22 h。兩種菌增殖后的受損細(xì)菌濃度與正常細(xì)菌濃度都基本一致,說明熱壓結(jié)合處理對兩種菌的生長起到了抑制的效果,但并沒有最終完全殺死細(xì)菌,只對細(xì)菌的生長有延緩作用,在營養(yǎng)充足、條件適宜的情況下，細(xì)菌會緩慢恢復(fù)正常的生長繁殖過程。

2.3 熱壓結(jié)合處理對細(xì)胞形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)的影響

通過掃描電鏡可以直觀的觀察細(xì)菌形態(tài)的變化。由圖2看出,熱壓結(jié)合處理前的綠色魏斯菌呈短桿狀,腸膜明串珠菌呈球狀,兩者細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整光滑。熱壓結(jié)合處理后,兩種菌細(xì)胞外形都有輕微變形,有明顯凹陷。這表明熱壓結(jié)合處理會導(dǎo)致細(xì)胞外形的改變,細(xì)胞膜本身因?yàn)榱字p分子結(jié)構(gòu)具有一定的流動性和彈性[23-24],但在細(xì)菌接受熱壓結(jié)合處理到用戊二醛固定的一段時間里,細(xì)胞膜上的凹陷沒有回彈,即熱壓結(jié)合處理會對細(xì)胞膜的彈性和流動性造成破壞。但是細(xì)胞整體形態(tài)完整,說明熱壓結(jié)合處理并沒有能夠完全破碎這兩種耐壓菌,它們的細(xì)胞膜雖然有些變形,但是依然抵抗住了大部分的高壓和熱處理,可以推測這兩種菌的耐壓耐熱性來自于細(xì)胞膜的防護(hù)能力。

圖2 熱壓結(jié)合處理前后綠色魏斯菌和腸膜明串珠菌掃描電鏡圖Fig.2 Scanning electron microscopy(SEM)examination of Weissella viridescensand Leuconostoc mesenteroides untreated and treated by HPTS注:A為綠色魏斯菌,B為腸膜明串珠菌;A-1和B-1為未處理樣,A-2和B-2為處理樣。

透射電鏡圖直觀地反映了熱壓結(jié)合處理對綠色魏斯菌細(xì)胞和腸膜明串珠菌的超微結(jié)構(gòu)變化。由圖3可以看出,未處理的綠色魏斯菌呈短桿狀,腸膜明串珠菌呈圓球狀,細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)完整光滑,細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)分布均勻。經(jīng)熱壓結(jié)合處理后,細(xì)菌細(xì)胞有一定程度的變形,細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞質(zhì)局部皺縮,出現(xiàn)團(tuán)狀聚集和透電子區(qū)[25](圖中箭頭標(biāo)記區(qū)域即為透電子區(qū))，細(xì)胞內(nèi)含物結(jié)構(gòu)紊亂,胞漿蛋白凝固、核酸變性,但是細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)基本完整。從以上細(xì)菌細(xì)胞受損情況分析,熱壓結(jié)合處理引起的細(xì)胞內(nèi)含物質(zhì)變性凝固是導(dǎo)致微生物死亡的關(guān)鍵原因。

圖3 熱壓結(jié)合處理前后綠色魏斯菌和腸膜明串珠菌的透射電鏡圖Fig.3 Transmission electron microscopy(TEM)examination of Weissella viridescensand Leuconostoc mesenteroides untreated and treated by HPTS 注:A為綠色魏斯菌,B為腸膜明串珠菌;A-1和B-1為未處理樣,A-2和B-2為處理樣。

掃描電鏡和透射電鏡結(jié)果表明，熱壓結(jié)合處理會對綠色魏斯菌和腸膜明串珠菌的細(xì)胞膜形態(tài)和內(nèi)部微觀結(jié)構(gòu)都產(chǎn)生了影響。

2.4 熱壓結(jié)合處理對細(xì)胞生理狀態(tài)的影響

圖4中P1區(qū)域?yàn)镾YTO9陽性對照,此區(qū)域代表細(xì)菌細(xì)胞膜完整,為活細(xì)胞所在區(qū)域;P2區(qū)域?yàn)镻I陽性對照,此區(qū)域細(xì)菌細(xì)胞膜獲得全透性,為死亡細(xì)胞所在區(qū)域;P3區(qū)域介于P1和P2區(qū)域之間,此區(qū)域細(xì)菌細(xì)胞膜處于完整和全透之間,可以認(rèn)為是受損細(xì)胞所在區(qū)域,這部分細(xì)菌處于亞致死狀態(tài)。根據(jù)圖4流式細(xì)胞儀分析死亡、受損及完整細(xì)胞時發(fā)現(xiàn),綠色魏斯菌熱壓結(jié)合處理后,94.3%細(xì)胞處于P1區(qū)域,受損細(xì)胞的比例達(dá)到5.0%,只有極少部分細(xì)胞細(xì)胞膜通透性略有提高,處于P3區(qū)域內(nèi)。腸膜明串珠菌熱壓結(jié)合處理后,P3區(qū)域受損細(xì)胞的比例達(dá)到99.3%,P1和P2區(qū)域幾乎沒有,這表明熱壓結(jié)合處理后,腸膜明串珠菌的細(xì)胞膜通透性發(fā)生明顯改變,但沒有達(dá)到全透性。

近年來，流式細(xì)胞技術(shù)因其快速準(zhǔn)確的單細(xì)胞分析能力,在微生物領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注。相對于傳統(tǒng)方法的宏觀測量,流式細(xì)胞術(shù)與各種熒光染料結(jié)合能更好地從微觀角度了解細(xì)菌的單細(xì)胞狀態(tài),如檢測細(xì)胞周期變化、細(xì)胞數(shù)量及其群體結(jié)構(gòu)變化,其檢測的標(biāo)準(zhǔn)主要是基于對于細(xì)胞膜完整性的反應(yīng),可區(qū)分反應(yīng)過程中的細(xì)胞狀態(tài)(活細(xì)胞、受損細(xì)胞和死亡細(xì)胞)[26-27]。流式細(xì)胞技術(shù)在染色步驟使用的染料是實(shí)現(xiàn)其各種功能的關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)采用了SYTO9和PI復(fù)染來研究細(xì)胞生理狀態(tài)。PI染料不能透過完整細(xì)胞膜,因此只會對細(xì)胞膜破損的細(xì)胞染色,而SYTO9染料可以對所有細(xì)胞染色,但當(dāng)PI染料存在時會被減弱熒光強(qiáng)度,因此通過熒光強(qiáng)度的差別可以較清晰的區(qū)別細(xì)胞膜損傷程度,完整細(xì)胞的SYTO9通道熒光信號最強(qiáng),而死亡的細(xì)胞PI通道熒光信號最強(qiáng),熒光信號介于兩者之間的可以定位為處于亞致死狀態(tài)的細(xì)胞。

結(jié)果顯示,綠色魏斯菌熱壓結(jié)合處理后,大部分細(xì)胞膜通透性與活細(xì)胞相同,與韓衍青的結(jié)果基本一致[4],這表明綠色魏斯菌的細(xì)胞膜通透性未發(fā)生明顯改變,大部分仍與活細(xì)胞細(xì)胞膜通透性相同,只有極少部分通透性略有提高。腸膜明串珠菌熱壓結(jié)合處理后,細(xì)胞膜通透性發(fā)生明顯改變,但沒有達(dá)到全透性,細(xì)胞膜通透性處于受損細(xì)胞的區(qū)域內(nèi),即亞致死狀態(tài)。兩種菌在熱壓結(jié)合處理后細(xì)胞膜都未獲得全透性,這可能是熱壓結(jié)合處理只能抑制細(xì)菌生長而不能完全將其殺死的一個重要原因。因流式細(xì)胞計數(shù)得到的細(xì)菌數(shù)量普遍高于普通平板計數(shù)方式[4],故此實(shí)驗(yàn)得到的活細(xì)胞比例高于平板計數(shù),可能是有一部分處于亞致死狀態(tài)的細(xì)菌細(xì)胞膜受損不嚴(yán)重,PI染料未能進(jìn)行染色,但其雖暫時具有活性,卻不可培養(yǎng)[28]。兩種菌的流式細(xì)胞數(shù)據(jù)也能看出熱壓結(jié)合處理對腸膜明串珠菌的效果優(yōu)于綠色魏斯菌,這種差異與平板計數(shù)得到的存活率結(jié)果相符,說明細(xì)胞膜通透性的改變與熱壓結(jié)合殺菌效果有直接關(guān)系。這些都說明這兩種菌細(xì)胞膜的防護(hù)作用是其耐壓耐熱的主要原因。

2.5 熱壓結(jié)合處理對胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)泄漏量的影響

表2可知,經(jīng)熱壓結(jié)合處理的兩種菌上清液中核酸(260 nm)、蛋白質(zhì)(280 nm)兩種物質(zhì)的含量極顯著增加(p<0.001),綠色魏斯菌熱壓結(jié)合處理后A260和A280分別增加了0.3952和0.1124,腸膜明串珠菌熱壓結(jié)合處理后A260和A280分別增加了0.2094和0.0972。說明熱壓結(jié)合處理會導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性變大,使得一些蛋白質(zhì)和核酸物質(zhì)流出細(xì)胞外。

表2 熱壓結(jié)合處理前后綠色魏斯菌和腸膜明串珠菌的紫外吸收物質(zhì)泄漏量Table 2 UV-absorbing substances leaking of Weissella viridescens and Leuconostoc mesenteroides untreated and treated by HPTS

由于核酸的組成中含有嘌呤、嘧啶堿基,蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán),這些結(jié)構(gòu)都具有共軛雙鍵(—C—C=C—C=C—),所以在紫外光區(qū)有強(qiáng)烈的光吸收作用,核酸和蛋白質(zhì)的最大吸收峰分別在260、280 nm附近。因此可通過測定260、280 nm處的紫外吸收強(qiáng)度來確定細(xì)胞內(nèi)核酸和蛋白質(zhì)物質(zhì)的泄漏情況[29]。但是超高壓和熱處理都會對核酸造成變性,堿基暴露,使其在260 nm處吸光度增加[30],故兩種菌在260 nm處的吸光度增加量不能定量比較,即不能比較兩種菌核酸流失量的多少,只能定性地說熱壓結(jié)合處理造成兩種菌的核酸流失。同時,這兩種菌作為原核生物缺少核膜,所以重要的遺傳物質(zhì)和功能性蛋白的流失將極大影響其正常代謝。而有些受損情況較輕的細(xì)胞經(jīng)過復(fù)蘇恢復(fù)成正常細(xì)胞,這些細(xì)胞可能細(xì)胞膜破損情況較輕,只有少數(shù)質(zhì)粒等核酸物質(zhì)流失[31],并沒有影響到細(xì)胞最根本的功能,只是失去了某些特性,而細(xì)胞膜受損情況較重的細(xì)胞因失去了大量與代謝、遺傳相關(guān)的生物大分子,最終只能死亡。綠色魏斯菌細(xì)胞膜受到的損傷較小,細(xì)胞膜完整性基本保持,能更好地進(jìn)行復(fù)蘇,而腸膜明串珠菌的損傷較為嚴(yán)重,復(fù)蘇需要更長的時間,甚至有的細(xì)胞不能復(fù)蘇只能死亡。故細(xì)胞膜通透性改變導(dǎo)致的核酸蛋白的流失也是熱壓結(jié)合處理能滅菌的重要原因,但細(xì)胞膜通透性的改變才是最主要的因素。

3 結(jié)論

本文研究了熱壓結(jié)合處理對綠色魏斯菌和腸膜明串珠菌的抑制作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn),細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化、細(xì)菌細(xì)胞膜通透性增大和核酸、蛋白質(zhì)的流失是熱壓結(jié)合處理抑制耐壓微生物的重要原因,其中細(xì)胞膜通透性的改變是主要原因。正因?yàn)榧?xì)胞膜的耐熱耐壓特性,使得熱壓結(jié)合處理不能完全殺滅細(xì)菌,只能使其進(jìn)入一種亞致死狀態(tài)。熱壓結(jié)合處理可以有效地抑制耐壓菌的活性,延緩兩種耐壓菌株的生長,但不能起到完全滅菌的效果,所以需要探究如何更有效地破壞這兩種菌的細(xì)胞膜,尋求更優(yōu)的滅菌條件及滅菌方式。