羊棲菜褐藻糖膠的結(jié)構(gòu)表征及其抗氧化活性

,,,,, ,Mikhail Kusaikin,昌衡,*

(1.齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院),山東省科學(xué)院生物研究所,山東濟(jì)南 250103; 2.煙臺(tái)大境生態(tài)環(huán)境科技股份有限公司,山東煙臺(tái) 264003; 3.山東極貝爾生物科技有限公司,山東濟(jì)南 250014; 4.俄羅斯科學(xué)院遠(yuǎn)東分院,太平洋生物有機(jī)化學(xué)研究所,酶化學(xué)實(shí)驗(yàn)室,俄羅斯海參崴 690022)

羊棲菜(Sargassumfusiforme)隸屬于褐藻門馬尾藻科,廣泛分布于中國(guó)、日本和韓國(guó),是一種健康食品,具有很高的食用和藥用價(jià)值,我國(guó)藥典早有記載,并確定其功能和主治是“軟堅(jiān)散結(jié)、消痰、利水、用于癭瘤、瘰疬、睪丸腫瘤、痰飲水腫”。羊棲菜含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),包括蛋白質(zhì)、多糖和礦物質(zhì)。近年來的研究表明,多糖是羊棲菜中重要的活性物質(zhì),具有多種良好的生物活性,如抗凝血、抗腫瘤、降血糖、降血脂等[1-6]。但是,由于羊棲菜多糖分子量大,粘度高,單糖組成復(fù)雜,其分離純化非常困難,很難得到羊棲菜多糖純品[7],而且,羊棲菜多糖并非單一組分,而是由褐藻膠、褐藻糖膠和褐藻淀粉構(gòu)成,更為其分離純化帶來困難。

褐藻糖膠是羊棲菜中重要的多糖組分,通常定義為含有相當(dāng)數(shù)量的巖藻糖和硫酸基的多糖,是一種巖藻聚糖硫酸酯[8]。因其具有多種良好的生物活性,近年來受到人們的廣泛關(guān)注。何丹等[9]從羊棲菜中分離純化得到兩種褐藻糖膠,通過對(duì)DPPH、羥基自由基的清除能力來評(píng)價(jià)它們的抗氧化活性,但是這兩種褐藻糖膠的分子量分布廣泛,純度相對(duì)較低;丁浩淼等[10]從羊棲菜中分離得到三種多糖成分,發(fā)現(xiàn)它們具有非常強(qiáng)的羥基自由基清除能力、還原力和抗脂質(zhì)過氧化能力,但是并未對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。陳琳琳等[11]采用水提醇沉的方法從羊棲菜中提取得到粗品多糖,發(fā)現(xiàn)其對(duì)自由基有較好的清除能力。由上述結(jié)果可知,羊棲菜多糖抗氧化作用的研究主要集中在混合物方面,純化組分的抗氧化作用研究相對(duì)較少,尤其是羊棲菜褐藻糖膠的純化組分。

本研究擬從羊棲菜中分離純化得到純度高,結(jié)構(gòu)新穎的褐藻糖膠,通過測(cè)定DPPH自由基清除活性、超氧陰離子清除活性、ABTS+自由基清除活性、亞硝酸鹽清除活性和還原力評(píng)價(jià)其抗氧化活性,為后續(xù)羊棲菜褐藻糖膠的研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羊棲菜 購(gòu)于山東青島市南區(qū)市場(chǎng);葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品(重均分子量分別為21.1、47.1、107、200、344、708 kDa,純度≥99%) 美國(guó)Flu-ka公司;單糖標(biāo)準(zhǔn)品(甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖、巖藻糖、氨基葡萄糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸,純度≥99%)、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)和標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白(純度≥99%),Griess reagent 美國(guó)Sigma公司;乙腈(色譜純) 美國(guó)Tedia公司;溴化鉀(色譜純) 天津科密歐化學(xué)試劑有限公司;其它試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

DEAE-Sepharose Fast Flow 美國(guó)GE healthcare公司;Aglient Elipse XDB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm) 美國(guó)Agilent公司;Shodex ohpak SB-804HQ高效凝膠滲透色譜柱 日本Shodex公司;Agilent 1260高效液相色譜儀 美國(guó)Agilent公司;Nicolet Nexus 470紅外光譜儀 美國(guó)Thermo Electron公司;Infinite M200 PRO酶標(biāo)儀 瑞士Tecan公司;800Y高速多功能粉碎機(jī) 永康市鉑歐五金制品有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 羊棲菜褐藻糖膠的提取 羊棲菜褐藻糖膠的提取參照Silchenko等[12]的方法。新鮮羊棲菜藻體(200 g)用自來水洗凈,除去泥沙,40 ℃烘箱干燥72 h,粉碎機(jī)粉碎得藻體粉末。取適量藻體粉末,加入30倍體積的95%乙醇進(jìn)行脫脂,室溫下攪拌24 h。脫脂完畢后靜置,于5000 r/min離心20 min,收集沉淀部分,40 ℃烘干。取適量脫脂后的藻體粉末,加入2% CaCl2溶液,料液比為1∶30 g/mL,60 ℃下攪拌3 h,靜置,5000 r/min離心20 min,收集上層清液,使用超濾裝置進(jìn)行超濾、濃縮,截留分子量為100 kDa,待液體體積濃縮至原體積的1/10,加入4倍體積95%乙醇,醇沉,4 ℃靜置過夜12 h,5000 r/min離心20 min,收集沉淀部分。沉淀經(jīng)無水乙醇脫水后,得到羊棲菜褐藻糖膠粗品(SFP)(8.6 g)。

1.2.2 SFP的分離純化 利用 DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換柱(4.0 cm×30 cm)對(duì)SFP進(jìn)行分離純化[12]。稱取8.4 g SFP樣品,每400 mg進(jìn)行一次上樣,將其溶于2 mL去離子水中,超聲(400 W,40 kHz)使其完全溶解,5000 r/min離心10 min,吸取上層清液,加至陰離子交換柱中。采用0、0.5、1、2、3 mol/L NaCl溶液對(duì)SFP進(jìn)行梯度洗脫,收集0.5 mol/L洗脫組分,透析除鹽,濃縮凍干。所得樣品復(fù)溶后,按照前述方法,采用陰離子交換柱再次分離純化,0.5 mol/L NaCl溶液洗脫,收集洗脫液,透析除鹽,濃縮凍干,所得組分命名為SFP-2(0.97 g)。多糖純化時(shí),少量多次上樣且反復(fù)純化,可提高樣品的純度。

1.2.3 SFP-2純度和分子量測(cè)定 將不同分子量的系列葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)多糖樣品配制成5 mg/mL的溶液,采用HPGPC法測(cè)定多糖分子量。分析柱:Shodex ohpak SB-804HQ(7.6 mm×300 mm),示差折光檢測(cè)器在線檢測(cè),流動(dòng)相:0.1 mol/L Na2SO4,流速:0.5 mL/min,柱溫:35 ℃,進(jìn)樣量:20 μL。運(yùn)用GPC軟件以標(biāo)準(zhǔn)多糖分子量的對(duì)數(shù)對(duì)保留時(shí)間作圖,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算樣品的分子量,根據(jù)峰型判斷SFP-2的純度[13]。

1.2.4 理化性質(zhì)分析 采用硫酸苯酚法,以巖藻糖為標(biāo)準(zhǔn)品,測(cè)定總糖含量[14];采用Folin-酚法,以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品,測(cè)定蛋白含量[15];采用氯化鋇明膠比濁法,以硫酸鉀為標(biāo)準(zhǔn)品,測(cè)定硫酸基含量[16];采用咔唑-硫酸法,以葡萄糖醛酸為標(biāo)準(zhǔn)品,測(cè)定糖醛酸含量[17]。

1.2.5 單糖組成分析 采用PMP柱前衍生高效液相色譜法,對(duì)單糖組成進(jìn)行分析[18]。準(zhǔn)確稱取2 mg多糖樣品,加入1 mL 2 mol/L三氟乙酸,于105 ℃條件下水解6 h,水解液減壓蒸干,除掉多余的三氟乙酸,得完全酸水解單糖樣品。對(duì)單糖標(biāo)準(zhǔn)品及完全酸水解單糖樣品進(jìn)行PMP衍生,首先將其溶于100 μL蒸餾水,加入100 μL 0.3 mol/L NaOH溶液及120 μL 0.5 mol/L的PMP甲醇溶液,70 ℃水浴反應(yīng)60 min。反應(yīng)完畢后中和,用二氯甲烷萃取三次,盡量將未反應(yīng)的PMP除去,上層液體過0.22 μm的微孔濾膜后進(jìn)行高效液相色譜分析。色譜條件為:C18色譜柱(5 μm,4.6 mm×250 mm),柱溫35 ℃,流動(dòng)相為磷酸緩沖溶液/乙腈(83∶17,V/V),流速1.0 mL/min,紫外檢測(cè)器檢測(cè)。

1.2.6 紅外光譜分析 采用KBr壓片法進(jìn)行紅外光譜測(cè)定[19]:以純KBr壓片為空白,適量SFP-2與KBr粉末混合壓片測(cè)定樣品的紅外圖譜。分析儀器:Nicolet Nexus 470紅外光譜儀;掃描范圍:400～4000 cm-1。

1.2.7 抗氧化能力的測(cè)定

1.2.7.1 DPPH自由基清除活性 DPPH自由基清除活性參照Shimada等[20]的方法,并以維生素C(VC)為陽(yáng)性對(duì)照。將1 mL濃度分別為0.75、1.5、3、6、12 mg/mL的SFP-2溶液加至3 mL的0.004% DPPH乙醇溶液中。避光反應(yīng)30 min,于517 nm處測(cè)定吸光度值,并根據(jù)以下公式計(jì)算清除率:

清除率(%)=(1-A樣品/A空白)×100

式中:A空白為不加待測(cè)樣品的吸光度,A樣品為加入待測(cè)樣品的吸光度。

1.2.7.2 超氧陰離子自由基清除活性 超氧陰離子自由基清除活性參照Marklund等[21]的方法,并以VC為陽(yáng)性對(duì)照。將1 mL濃度分別為0.75、1.5、3、6、12 mg/mL的SFP-2溶液與3 mL 0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.2)混合,25 ℃孵育10 min。然后加入200 μL預(yù)熱的30 mmol/L鄰苯三酚溶液,充分混勻后于25 ℃下反應(yīng)4 min,加入0.5 mL濃鹽酸終止反應(yīng),并于320 nm處測(cè)定吸光度值。清除率按照以下公式計(jì)算:

清除率(%)=(1-A樣品/A空白)×100

式中:A空白為不加待測(cè)樣品的吸光度,A樣品為加入待測(cè)樣品的吸光度。

1.2.7.3 ABTS+自由基清除活性 ABTS+自由基清除活性參照Re等[22]的方法,以水溶性維生素E(VE)為陽(yáng)性對(duì)照,并稍作修改。將7.4 mmol/L的ABTS溶液與2.6 mmol/L的過硫酸鉀溶液等量混合,避光反應(yīng)12～16 h。取適量上述混合液,用甲醇稀釋至吸光度值穩(wěn)定在0.7±0.02,即得ABTS+工作液。將4 mL工作液與100 μL濃度分別為0.75、1.5、3、6、12 mg/mL的SFP-2溶液混合,室溫避光孵育5 min,于734 nm處測(cè)定吸光度。清除活性按照以下公式計(jì)算:

清除率(%)=(1-A樣品/A空白)×100

式中:A空白為不加待測(cè)樣品的吸光度,A樣品為加入待測(cè)樣品的吸光度。

1.2.7.4 亞硝酸鹽清除活性 亞硝酸鹽清除活性參照趙二勞等[23]的方法,以VC為陽(yáng)性對(duì)照,并稍作改進(jìn)。向1 mL 1 mmol/L NaNO2中加入1 mL濃度分別為0.75、1.5、3、6、12 mg/mL的SFP-2溶液,用1 mol/L的鹽酸溶液定容至10 mL,37 ℃下孵育60 min。取上述反應(yīng)液1 mL,加入4 mL 2%醋酸溶液和0.4 mL Griess reagent,混合均勻,室溫孵育15 min,于520 nm處測(cè)定吸光度值,清除活性按照以下公式計(jì)算:

清除率(%)=(1-A樣品/A空白)×100

式中:A空白為不加待測(cè)樣品的吸光度,A樣品為加入待測(cè)樣品的吸光度。

1.2.7.5 還原力測(cè)定 還原力實(shí)驗(yàn)參照Dorman等[24]的方法,并以VC為陽(yáng)性對(duì)照。分別向1 mL濃度分別為0.75、1.5、3、6、12 mg/mL的SFP-2溶液中加入0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH6.6)和1%的鐵氰化鉀溶液各2.5 mL,混合均勻,50 ℃下孵育20 min,加入10%的三氯乙酸溶液,混勻后離心(6000 r/min,10 min)。取2.5 mL上清液,加入2.5 mL去離子水和0.5 mL0.1%的三氯化鐵溶液,靜置使其充分反應(yīng)后于700 nm處測(cè)定吸光度值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程采用GPC軟件處理,抗氧化活性數(shù)據(jù)采用Microsoft Office Excel 2007處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖純度和理化性質(zhì)分析

通過高效凝膠滲透色譜對(duì)多糖的純度進(jìn)行分析,結(jié)果如圖1所示,SFP-2在HPGPC色譜上呈現(xiàn)單一對(duì)稱峰,峰型高窄,峰寬在5 min以內(nèi),表明多糖的純度較高[25]。根據(jù)分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2)計(jì)算可得,SFP-2的分子量為707.0 kDa。理化性質(zhì)分析表明(表1),多糖的總糖含量為66.9%;蛋白含量為3.1%,表明蛋白含量較低;硫酸基含量為21.2%,表明多糖為硫酸化多糖;未檢測(cè)到糖醛酸,說明多糖不含糖醛酸,這與以往的研究顯著不同[26-27]。Hu等[26]分離得到的羊棲菜褐藻糖膠均含有糖醛酸,且含量較高,這可能是由于藻類生長(zhǎng)地域、生長(zhǎng)環(huán)境不同造成的。

圖1 多糖SFP-2的高效凝膠滲透色譜圖Fig.1 HPGPC chromatography of the polysaccharide SFP-2

表1 SFP-2的理化性質(zhì)分析Table 1 Physico-chemical analysis of SFP-2

圖2 分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The standard curve of the molecular weight

2.2 單糖組成分析

SFP-2的柱前衍生HPLC色譜圖如圖4所示,與單糖標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖(圖3)對(duì)比可知,SFP-2主要含有巖藻糖和半乳糖,還含有少量的甘露糖和氨基葡萄糖,Fuc(巖藻糖)∶Gal(半乳糖)∶Man(甘露糖)∶GlcN(氨基葡萄糖)摩爾比約為2.50∶1.0∶0.15∶0.01,不含糖醛酸,這與理化性質(zhì)分析相符。SFP-2的單糖組成比較簡(jiǎn)單,只含四種單糖,不含糖醛酸。這與以往的研究顯著不同,李波等[27]從羊棲菜中得到的褐藻糖膠含有七種單糖,包括巖藻糖、甘露糖、半乳糖、木糖、葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖,Hu等[26]從羊棲菜中得到的褐藻糖膠也含有七種單糖,其中包含了兩種糖醛酸,葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸。此外,根據(jù)巖藻糖和硫酸基含量可知,SFP-2是一種巖藻聚糖硫酸酯,即褐藻糖膠。

圖4 SFP-2的單糖組成分析Fig.4 The monosaccharide composition analysis of polysaccharide SFP-2

圖3 單糖標(biāo)準(zhǔn)品的液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of the standard monosaccharides

2.3 紅外光譜分析

紅外光譜圖可以給出多糖中常見官能團(tuán)的吸收峰[28]。多糖組分SFP-2的紅外光譜如圖5所示。3458 cm-1處為多糖的O-H伸縮振動(dòng)吸收峰;2943 cm-1處為多糖C-H伸縮振動(dòng)吸收峰;1645 cm-1處為多糖類物質(zhì)常見的微量水分締合羥基造成;1046 cm-1處的吸收信號(hào)為多糖糖殘基之間糖苷鍵C-O-C的伸縮振動(dòng)吸收峰,各糖殘基之間的連接方式及順序的不同導(dǎo)致此處的峰形不規(guī)則,1046 cm-1處的兩個(gè)主峰因糖苷鍵比例不同大小、位置略有變化;1245 cm-1處的強(qiáng)峰為S=O伸縮振動(dòng)吸收峰,835 cm-1處為C-O-S的伸縮振動(dòng)吸收峰,均為硫酸基的特征吸收峰,進(jìn)一步證明此多糖為硫酸化多糖。

圖5 多糖SFP-2的紅外光譜圖Fig.5 IR spectrum of polysaccharide SFP-2

2.4 抗氧化活性分析

對(duì)SFP-2進(jìn)行了體外抗氧化活性測(cè)定,包括DPPH自由基、超氧陰離子自由基、ABTS+自由基、亞硝酸鹽清除活性以及還原力等指標(biāo),多方面評(píng)價(jià)了多糖的抗氧化活性。

2.4.1 DPPH自由基清除活性 SFP-2的DPPH自由基清除活性如圖6所示,清除率呈現(xiàn)劑量依賴性,隨著濃度的增加,清除能力逐漸增加,當(dāng)濃度為12 mg/mL時(shí),清除率達(dá)59.12%。SFP-2顯示了較好的清除DPPH自由基的活性,其EC50為8.94 mg/mL。VC作為陽(yáng)性對(duì)照,具有極強(qiáng)的清除自由基的活性,當(dāng)濃度為0.75 mg/mL時(shí),清除率為93.68%,濃度繼續(xù)升高,清除率幾乎不變,表明達(dá)到最大清除活性。上述結(jié)果表明,SFP-2是相對(duì)有效的DPPH自由基清除劑,可有效防止DPPH自由基引起的損害。SFP-2的DPPH自由基清除活性高于陳琳琳等[11]提取得到的羊棲菜多糖提取物EFSP,濃度為15 g/L時(shí),EFSP的清除率為57.02%;低于何丹等[9]所得兩種羊棲菜褐藻糖膠的清除活性。

圖6 DPPH自由基清除活性Fig.6 Scavenging ability of DPPH radicals

2.4.2 超氧陰離子清除活性 SFP-2的超氧陰離子清除活性如圖7所示,隨著多糖濃度的增加,清除能力增強(qiáng),且當(dāng)濃度為12 mg/mL時(shí),清除率達(dá)54.27%,其EC50為8.30 mg/mL。上述結(jié)果表明,SFP-2具有良好的清除超氧陰離子活性。但是,此清除率低于丁浩淼等[10]從羊棲菜中分離得到的三種多糖成分,這三種多糖中,其中一種超氧陰離子清除活性略優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照VC,而SFP-2的清除率明顯低于VC。

圖7 超氧陰離子清除活性Fig.7 Scavenging ability of superoxide radicals

2.4.3 ABTS+自由基清除活性 ABTS+自由基清除活性是衡量化合物抗氧化能力的重要指標(biāo),圖8顯示了SFP-2對(duì)ABTS+自由基的清除活性,隨著多糖濃度的增加,清除能力逐漸增強(qiáng),當(dāng)濃度為12 mg/mL時(shí),清除率達(dá)到40.41%,其EC50為16.04 mg/mL,相對(duì)于其他自由基清除活性,清除能力稍弱,但是,仍舊具有一定的ABTS+自由基清除活性。

圖8 ABTS+自由基清除活性Fig.8 Scavenging ability of ABTS+radicals

2.4.4 亞硝酸鹽清除活性 圖9顯示了SFP-2對(duì)亞硝酸鹽的清除活性,隨著濃度的增加,清除率逐漸增加,當(dāng)濃度為12 mg/mL時(shí),清除率可達(dá)50.72%,其EC50為9.87 mg/mL,表明多糖有良好的清除亞硝酸鹽的能力。

圖9 亞硝酸鹽清除活性Fig.9 Scavenging ability of nitrite

2.4.5 還原力 還原力可代表待測(cè)物的總體抗氧化水平,圖10顯示了SFP-2的還原能力。隨著濃度的增加,還原力呈現(xiàn)增強(qiáng)趨勢(shì),濃度越大,吸光度值越大。當(dāng)濃度為12 mg/mL時(shí),吸光度值為1.49,而VC組的吸光度值為3.10,多糖樣品的吸光度值約為VC的一半,這表明SFP-2具有一定的還原力活性。但是,SFP-2的還原力低于丁浩淼等[10]從羊棲菜中分離得到三種多糖成分,三種多糖中,有一種組分還原力活性高于陽(yáng)性對(duì)照VC,而SFP-2的還原力與VC相差較大。

圖10 還原力Fig.10 Reducing power

多糖SFP-2的結(jié)構(gòu)、抗氧化活性均與以往的研究有所不同,這可能與羊棲菜本身的生長(zhǎng)環(huán)境、生長(zhǎng)地域、多糖的提取方式、純化方式有關(guān)。

3 結(jié)論

從羊棲菜中提取得到褐藻糖膠,并通過純化得到電荷密度均勻、分子量均一的組分SFP-2,測(cè)定了其純度、分子量、理化性質(zhì)、單糖組成、紅外光譜等。結(jié)果表明,SFP-2是一種分子量較大、不含糖醛酸的巖藻聚糖硫酸酯?；钚詼y(cè)定結(jié)果表明,SFP-2具有良好的抗氧化活性,其抗氧化活性呈現(xiàn)劑量依賴性,隨著濃度的升高活性逐漸增強(qiáng)。SFP-2的DPPH自由基清除活性、超氧陰離子清除活性、ABTS+自由基清除活性、亞硝酸鹽清除活性EC50分別為8.94、8.30、16.04、9.87 mg/mL,且具有一定還原能力。本文為進(jìn)一步研究羊棲菜褐藻糖膠的精細(xì)結(jié)構(gòu)、體內(nèi)抗氧化活性以及抗氧化作用機(jī)制提供了參考。