利用高效液相色譜-飛行時間質譜 和高效液相色譜-三重四級桿質譜 檢測南美白對蝦的過敏原

,,,,,,,,*

(1.中國海洋大學食品科學與工程學院,山東青島 266003; 2.山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心,山東青島 266002)

近年來,食品安全問題已成為人們普遍關心的問題[1],其中食物過敏問題也越來越受到人們的重視[2]。世界衛(wèi)生組織(WTO)和聯(lián)合國糧農組織(FAO)已將過敏疾病認定為當今世界性的重大問題之一[3-4]。調查顯示,一些西方國家2.5%的成年人和6%～8%的兒童會有過敏疾病[5]。在中國,約有6%的人群患有過敏疾病[6]。特別在中國沿海地區(qū),海產品的消費量很大,因食用海產品而過敏的消費者逐年增加,以及過敏的長期性和嚴重性,使得海產品過敏成為重要的公共健康問題[7]。蝦與蟹等甲殼類動物及其制品是引起食物過敏較常見的一類食品[8],且多數(shù)為終生過敏[9]。蝦類過敏反應嚴重影響著過敏人群的身體健康和生活質量[10],極微量的過敏原就能導致嚴重的過敏反應[11]。

南美白對蝦作為海蝦淡養(yǎng)的優(yōu)良品種[12],其養(yǎng)殖在我國各地得以迅速推廣[13],因此有必要對南美白對蝦的過敏原進行檢測分析。目前,已有許多關于南美白對蝦過敏原檢測相關研究。García-Orozco等[14]對南美白對蝦的一種過敏原精氨酸激酶的分子特性進行了研究。吳海明[15]對南美白對蝦過敏原進行了鑒定并用酶法消減。這些方法為過敏原的檢測提供了一定技術支持。但是,隨著水產品市場需求不斷擴大,亟需開發(fā)一種高通量、靈敏準確且操作簡便的水產品過敏原檢測方法。

高效液相色譜作為一種新的液相色譜技術,相對于常規(guī)液相色譜而言,有更好的分離效率、峰容量以及靈敏度[16]。這一技術與能夠測定化合物的精確質量并與具有MS/MS功能的飛行時間質譜(time-of-flight mass spectrometer,TOF-MS)聯(lián)用,成為復雜體系分離分析以及化合物結構鑒定的良好平臺[17],在水產品過敏原鑒定方面具有很大的潛力。三重四級桿質譜以其高靈敏、精確度和重現(xiàn)性[18],在分析檢測中起到了重要作用。因此,本研究采用高效液相色譜-飛行時間質譜檢測南美白對蝦的過敏原,并初步建立了三重四級桿多反應檢測模式快速檢測表征過敏原肽段的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

南美白對蝦 市售;測序級胰蛋白酶(18523 U/mg) 美國Promega公司;甲酸(質譜級) 美國Sigma公司;乙腈 美國Fisher公司;碘代乙酰胺 美國Sigma公司;Folin-酚乙液 北京索萊寶科技有限公司;二硫蘇糖醇、尿素、碳酸氫銨、碳酸鈉、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉、五水硫酸銅、牛血清蛋白 國藥集團化學試劑有限公司。

Nexera X2 30A高效液相色譜儀 日本島津公司;1290高效液相色譜 美國Agilent 公司;AB SCIEX Triple TOF? 5600質譜儀 美國SCIEX公司;Triple QuadTM 5500三重四級桿質譜儀 美國SCIEX公司;MQS50001型超純水系統(tǒng) 美國Millipore公司;AB135-S型精密電子分析天平 瑞士Mettler-Toledo公司;A11分析研磨機 德國IKA公司;CR21G II高速冷凍離心機 日本CHTACHI公司;UFC501008超濾管 美國Millipore公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 南美白對蝦蛋白的提取 取六個體形完整的南美白對蝦,肌肉用液氮研磨成粉末。取1 g蝦粉,用10 mL蛋白提取液(8 mol/L尿素,50 mmol/L NH4HCO3),垂直振蕩30 min,高速低溫離心20 min(4 ℃,15000 r/min),取上清液,測其蛋白含量,實驗平行三次。

1.2.2 提取液蛋白含量的測定 采用Folin-酚法[19]。

1.2.2.1 溶液的配制 Folin-酚甲液由A液和B液5∶1混合而成,臨用時現(xiàn)配(A液:10 g碳酸氫鈉,2 g氫氧化鈉,0.25 g酒石酸鉀鈉溶于500 mL蒸餾水;B液:0.25 g五水硫酸銅溶于100 mL蒸餾水水中),乙液為商品化試劑。

1.2.2.2 標準曲線的制作 取6支試管,分別加入0、200、400、600、800、1000 μL mg/mL的牛血清白蛋白(BSA)溶液,用蒸餾水補足到1 mL。每管加入Folin-酚甲液5 mL,搖勻,于25 ℃靜置10 min。每管加入Folin-酚乙液0.5 mL,迅速搖勻,30 ℃靜置30 min,以蒸餾水為空白,在650 nm處比色測吸光值,實驗重復三次。

1.2.2.3 南美白對蝦蛋白含量的測定 為了準確測定南美白對蝦提取液的蛋白含量,必須使吸光度在線性范圍內,因此取1.2.1中的上清原液以及10～1000倍梯度稀釋的樣品,取樣量為1 mL,每管加入Folin-酚甲液5 mL,搖勻,于25 ℃靜置10 min。每管加入Folin-酚乙液0.5 mL,迅速搖勻,30 ℃靜置30 min,以蒸餾水為空白,在650 nm處比色測吸光值,實驗重復三次。

1.2.3 蛋白提取液胰蛋白酶酶解 參考Wisniewski等[20]和Mi等[21]的方法,取1.2.1制得的上清液100 μL,分別加入2 μL 1 mol/L二硫基蘇糖醇在60 ℃反應1 h,實驗重復三次。取5 μL 1 mol/L現(xiàn)配的碘代乙酰胺,加入到已經冷卻至室溫的上述反應液中,室溫避光反應1 h。采用10K超濾離心管在15000 r/min離心超濾20 min后,每次用200 μL 50 mmol/L碳酸氫銨溶液洗滌膜上層蛋白,共洗滌三次。最后在膜上層加入200 μL 50 mmol/L碳酸氫銨溶液作為緩沖液,并按酶和底物比1∶50,將胰蛋白酶溶液加入到上述蛋白溶液中,混勻并在37 ℃酶解16 h,使酶解徹底。在超濾離心管15000 r/min離心超濾20 min,收集下層的肽段濾液,待上機檢測。

1.2.4 南美白對蝦肽段的分離和檢測

1.2.4.1 高效液相色譜-飛行時間質譜法 液相色譜條件:色譜柱為安捷倫AdvanceBio Peptide Map column(150 mm×2.1 mm,130 ?,2.7 μm);柱溫:40 ℃。流動相A:0.1%甲酸-乙腈,流動相B:0.1%甲酸-水;流速:0.25 mL/min;進樣量:30 μL;進樣時間:46 min;流動相梯度:0～2 min(95% B),2～17 min(95%～80% B),27～37 min(85%～65% B),37～39 min(65%～20% B),39～42 min(20%～95% B),42～46 min(95% B)。質譜條件:質譜掃描范圍為350～1500 Da,正離子反應模式,霧化氣GS1:35 psi,輔助加熱器GS2:45 psi,氣簾氣壓:35 psi,噴霧電壓5500 eV,離子源溫度:500 ℃,解簇電壓:100 V,碰撞能量:10 eV,信號強度閾值:2e4。

1.2.4.2 高效液相色譜-三重四級桿質譜法

傳輸離子對的確定:為了提高過敏原肽段的靈敏度和選擇性,使用Skyline軟件產生傳輸離子對,并優(yōu)化傳輸離子對的碰撞能量(CE)和解簇電壓(DP),建立三重四級桿MRM的方法。每條肽段選擇5對響應強度最高的傳輸離子對,駐留時間設置為5 ms。通過檢測肽段的傳輸離子對來鑒定肽段,并使用肽段來表征過敏原蛋白。

高效液相色譜-三重四級桿質譜參數(shù):液相色譜條件:色譜柱為安捷倫Advance Bio Peptide Map column(150 mm×2.1 mm,130 ?,2.7 μm);柱溫:40 ℃。流動相A:0.1%甲酸-乙腈,流動相B:0.1%甲酸-水;流速:0.35 mL/min;進樣量為20 μL;流動相梯度:0～0.5 min,5% B;0.5～17 min,5%～35% B;17～17.5 min,35%～95% B;17.5～20 min,95% B;20～20.1 min,95%～5% B;20.1～25 min,5% B。質譜條件:正離子模式,噴霧電壓為5500 V,霧化氣為35 psi,離子源溫度為575 ℃。

1.3 數(shù)據(jù)處理

質譜和計算機采集肽段質荷比和保留時間、響應強度等數(shù)據(jù),生成wiff文件,導入Protein Pilot軟件,檢索NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)南美白對蝦(LitoLitopenaeus vannamei)的蛋白數(shù)據(jù)庫。ProteinPilot軟件參數(shù)設置如下:搜庫方法:Paragon method;消化:Trypsin;儀器:TripleTOF 5600;物種:None;ID Focus:Amino acid Subtitutions,Biological modifications;Search Effort:Thorough ID;檢測蛋白質閾值(Unused Protscore(conf)):>0.05%(10.0%);提交錯誤發(fā)現(xiàn)率(False Discovery rate analysis,FDR)分析報告。

2 結果與分析

2.1 南美白對蝦提取液蛋白含量的測定結果

2.1.1 標準曲線的建立 以牛血清蛋白含量為橫坐標,650 nm處吸光值為縱坐標,線性回歸方程為:y=2.7834x+0.0149(R2=0.9975),繪制的標準曲線如圖1所示。

圖1 蛋白含量標準曲線Fig.1 Standard curve of protein content

2.1.2 南美白對蝦提取液中的蛋白含量 采用稀釋100倍的樣品,測得650 nm處的吸光值平均數(shù)為0.601,換算成提取液蛋白含量為20.7 mg/mL。

2.2 南美白對蝦蛋白胰蛋白酶降解產物的分析

2.2.1 高效液相色譜-飛行時間質譜分析 南美白對蝦蛋白胰蛋白酶降解產物經高效液相色譜-飛行時間質譜檢測分析,觀察得到的譜圖,發(fā)現(xiàn)其譜峰尖銳,峰形較為對稱,數(shù)據(jù)采集情況良好,譜圖重現(xiàn)性好。高效液相色譜-飛行時間質譜上南美白對蝦蛋白胰蛋白解產物得到的有代表性的總離子流色譜圖如圖2所示。

圖2 高效液相色譜-飛行時間質譜上南美白對蝦 蛋白胰蛋白解產物得到的有代表性的總離子流色譜圖Fig.2 Representative total ion chromatogram (TIC)scan spectra of hydrolysate of Litopenaeus vannamei on HPLC-QTOF

南美白對蝦蛋白胰蛋白酶降解產物經超高效液相色譜-飛行時間質譜檢測,采集的數(shù)據(jù)在Protein Pilot軟件中用NCBI的南美白對蝦數(shù)據(jù)庫進行譜庫檢索。在95%的置信度下,共鑒定出7種過敏原,分別是原肌球蛋白、精氨酸激酶、肌球蛋白輕鏈、血藍蛋白亞基L1、血藍蛋白亞基L2、血藍蛋白亞基L3、肌鈣蛋白C1,對應的肽段條數(shù)分別為214、16、84、145、225、163和93條。表1列出了南美白對蝦中過敏原的蛋白名稱和NCBI中的登記號,以及每個過敏原蛋白對應的響應強度最高的10條肽段。

表1 南美白對蝦中的過敏原及代表性肽段Table 1 Allergens of Litopenaeus vannamei and representative peptides

2.2.2 高效液相色譜-三重四級桿質譜分析

2.2.2.1 產生傳輸離子對 Skyline軟件產生的傳輸離子對及對應的碰撞能量和解簇電壓如表2所示。為了簡化說明,僅選取3條代表性的過敏原肽段作為示例。

表2 Skyline預測的南美白對蝦過敏原代表性肽段解簇電壓和碰撞能量Table 2 The declustering potential and collision energy values of representative peptide of Litopenaeus vannamei predicted by Skyline

2.2.2.2 MRM結果 高效液相色譜-三重四級桿質譜上南美白對蝦蛋白胰蛋白解產物得到的的總離子流色譜圖和提取離子流色譜圖如圖3所示。圖4為南美白對蝦過敏原代表性肽段DNAMDR的提取離子色譜圖和二級質譜圖,母離子為361.15,子離子分別為492.22、421.19、290.15、175.12、230.08,其保留時間為1.58 min。圖5為南美白對蝦過敏原代表性肽段LSSLEGELK的提取離子色譜圖和二級質譜圖,母離子為488.27,子離子分別為862.45、775.42、575.30、446.26、201.12,其保留時間為7.67 min。圖6為南美白對蝦過敏原代表性肽段SEEEVHNLQK的提取離子色譜圖和二級質譜圖,母離子為635.30,子離子分別為795.44、696.37、559.31、217.08、475.17,其保留時間為2.10 min。

圖3 南美白對蝦胰蛋白酶解產物在高效液相色譜-三重四級桿質譜上的總離子流圖和提取離子流色譜圖Fig.3 Representative total ion chromatogram(TIC)scan spectra and extracted ion chromatogram(XIC) scan spectra of hydrolysate of Litopenaeus vannamei on triple quadrupole mass spectrometer注:A為總離子流色譜圖,B為提取離子流色譜圖。

圖4 肽段DNAMDR的提取離子色譜圖和二級質譜圖Fig.4 Representative extracted ion chromatogram(XIC) scan spectra and secondary ion mass spectrometry(SIMS)of peptide DNAMDR注:a～e為提取離子色譜;f為二級質譜圖;圖5～圖6同。

圖5 肽段LSSLEGELK的提取離子色譜圖和二級質譜圖Fig.5 Representative extracted ion chromatogram(XIC) scan spectra and secondary ion mass spectrometry(SIMS)of peptide LSSLEGELK

圖6 肽段SEEEVHNLQK的提取離子色譜圖和二級質譜圖Fig.6 Representative extracted ion chromatogram(XIC)scan spectra and secondary ion mass spectrometry(SIMS)of peptide SEEEVHNLQK

3 結論

采用高效液相色譜-飛行時間質譜共檢測出南美白對蝦中7種過敏原,分別是原肌球蛋白、精氨酸激酶、肌球蛋白輕鏈、血藍蛋白亞基L1、血藍蛋白亞基L2、血藍蛋白亞基L3、肌鈣蛋白C1,對應的肽段條數(shù)分別為214、16、84、145、225、163和93條。高效液相色譜-飛行時間質譜通過檢測母離子和子離子的精確質量數(shù),結合數(shù)據(jù)庫檢索可以匹配出肽段。高效液相色譜-三重四級桿質譜的MRM模式靈敏度高、選擇性好、操作簡單,但是需要預先設定母離子和子離子。本研究建立了一種檢測南美白對蝦過敏原的新思路:從高分辨飛行時間質譜發(fā)現(xiàn)過敏原的肽段到三重四級桿MRM方法的開發(fā)。本研究有助于進一步認識過敏原,為水產品的食用安全性提供一定的基礎理論依據(jù)。