景天三七總黃酮的純化、 自由基清除活性及初步鑒定

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(1.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,四川綿陽(yáng) 621010; 2.四川省生物質(zhì)資源利用與改性工程技術(shù)研究中心,四川綿陽(yáng) 621010)

景天三七(SedumaizoonL.),景天科植物又被稱(chēng)為高鈣菜、救心菜、土三七等[1],四川、浙江、陜西、甘肅、山西、寧夏、湖北、青海等地均有種植[2]。景天三七營(yíng)養(yǎng)豐富,有研究表明,景天三七具有降低血管硬化、促進(jìn)新陳代謝、抗氧化及解毒消腫等[3-5]作用,是有一定藥食潛力的資源。景天三七具有種植范圍廣,環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng),且采收期長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn),可以為功能性提取物的生產(chǎn)加工提供穩(wěn)定的原料來(lái)源。近年來(lái),黃酮類(lèi)化合物的研究在食品領(lǐng)域趨于熱門(mén),加快了對(duì)具有良好功能性的藥食同源的植物資源的開(kāi)發(fā),付煜榮等[6]采用顏色反應(yīng)檢識(shí)證明景天三七中含有黃酮類(lèi)化合物。張興桃等[7]通過(guò)超臨界CO2萃取景天三七總黃酮。

目前,對(duì)景天三七功能性成分的研究與開(kāi)發(fā)主要集中在黃酮類(lèi)、生物堿、甾醇[8-11]等活性成分。黃酮類(lèi)化合物具有抗氧化性、抗炎癥、抗病毒、抗菌[12-13]等功效,并對(duì)防治癌癥、腫瘤、心血管[14-16]等疾病具有重要意義。而關(guān)于景天三七中的黃酮類(lèi)化合物純化及性質(zhì)研究較少。本研究基于文獻(xiàn)報(bào)道[17-19],選用大孔樹(shù)脂靜態(tài)吸附方法純化景天三七總黃酮,并研究了景天三七總黃酮最佳純化工藝及其性質(zhì),為景天三七中黃酮類(lèi)化合物的系統(tǒng)性研究做出一定的補(bǔ)充。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

景天三七 均于2017年8月采自西南科技大學(xué)蔬菜實(shí)驗(yàn)園,新鮮,無(wú)蟲(chóng)害,并由統(tǒng)一干燥方法加工制樣;蘆丁對(duì)照品 南京替斯艾么中藥研究所 標(biāo)準(zhǔn)品;二苯代苦味肼基自由基(DPPH)、ABTS SIGMA ALDRICH 公司,分析純,抗氧化劑;乙醇、鹽酸、三氯乙酸、鐵氰化鉀、四硼酸鈉、硝酸鋁、抗壞血酸、鎂粉、鋅粉 成都市科龍化工試劑廠,分析純;D-101、AB-8、X-5、DA-201型大孔樹(shù)脂 成都市科龍化工試劑廠。

U-3900H型紫外分光光度計(jì) Hitachi日立公司;Agilent1200系列LC-MS 安捷倫公司;pH 510酸度計(jì) EUTECH INSTRUMENTS公司;FD-T12N-80型冷凍真空干燥儀 Thermo Electron Corporation;DJ靈巧型中藥粉碎機(jī) 海淀久中藥機(jī)械制造有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 景天三七總黃酮粗提物樣品液的制備 景天三七燙漂30 s后55 ℃烘干,置入中藥粉碎機(jī)粉碎,粉末過(guò)40目篩,取100 g粉碎后的景天三七經(jīng)由乙醇浸提(81 ℃,90%乙醇,料液比1∶44,浸提3 h),采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除醇后加入等體積石油醚萃取除雜,再次旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去石油醚,加入95%乙醇溶解,低溫靜置12 h后經(jīng)離心(4500 r/min,15 min)取上清液,濃縮除醇,進(jìn)行預(yù)凍過(guò)夜(0 ℃)后置于真空冷凍干燥機(jī)中干燥36 h得景天三七總黃酮粉末。精確稱(chēng)取0.1000 g總黃酮粉末,用30%乙醇微熱溶解后,用同濃度乙醇定容到100 mL,得1.00 mg·mL-1景天三七總黃酮粗提物樣品液,測(cè)定總黃酮實(shí)際含量,備用。

1.2.2 大孔樹(shù)脂的預(yù)處理 預(yù)處理過(guò)程為:將各樹(shù)脂用95%乙醇浸泡24 h后依次用乙醇、去離子水沖洗,至洗盡醇味;用5%鹽酸溶液處理,用去離子水洗至中性;最后用5%NaOH溶液處理,用去離子水洗至中性,保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 總黃酮含量測(cè)定 以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照,采用NaNO2-Al(NO3)3法[20]測(cè)定黃酮含量;進(jìn)行蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制和回歸方程的建立,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算所得回歸方程為y=1.1688x+0.0054,決定系數(shù)R2=0.9998,具有良好線性關(guān)系,x為蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液濃度(mg·mL-1)。

樣品的測(cè)定:準(zhǔn)確量取景天三七總黃酮粗提物樣品液1 mL。按上述方法測(cè)定吸光度,并帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算,得出總黃酮含量。

1.2.4 大孔樹(shù)脂靜態(tài)吸附-解吸附實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 大孔樹(shù)脂篩選 將預(yù)處理好的四種大孔樹(shù)脂(D101型、DA-201型、X-5型、AB-8型)抽濾并經(jīng)濾紙吸干后,各精確稱(chēng)取1.0 g于200 mL錐形瓶中,再準(zhǔn)確加入一定濃度的景天三七總黃酮樣品液25 mL。于30 ℃、振蕩頻率100 r/min的條件下振蕩吸附24 h后,測(cè)定平衡液總黃酮濃度Ce。分別抽濾后,將大孔樹(shù)脂移回錐形瓶中,準(zhǔn)確加入25 mL 95%乙醇,再在30 ℃、振蕩頻率100 r/min的條件下振蕩?kù)o態(tài)解吸附24 h后,測(cè)定解吸液總黃酮濃度Cd。通過(guò)比較吸附率、解吸率和回收率,篩選出理想型大孔吸附樹(shù)脂。

1.2.4.2 大孔樹(shù)脂靜態(tài)吸附-解吸附動(dòng)力學(xué)曲線 樹(shù)脂靜態(tài)吸附曲線:精確稱(chēng)取篩選出的大孔吸附樹(shù)脂1.00 g于200 mL三角錐形瓶中,加入25.00 mL濃度為0.7 mg·mL-1的景天三七總黃酮純化液。在pH為4.0、30 ℃、振蕩頻率100 r/min的條件下振蕩?kù)o態(tài)吸附7 h,每隔30 min取0.2 mL上清液測(cè)定總黃酮濃度計(jì)算吸附率,建立吸附率與時(shí)間的靜態(tài)吸附動(dòng)力曲線。

樹(shù)脂靜態(tài)解吸附曲線:將上述已經(jīng)吸附飽和的大孔吸附樹(shù)脂抽濾并用濾紙吸干后轉(zhuǎn)移到200 mL三角錐形瓶中,加入95%乙醇25 mL,在pH為4.0、30 ℃、振蕩頻率100 r/min的條件下振蕩?kù)o態(tài)解吸附7 h,每隔30 min取0.2 mL上清液測(cè)定總黃酮濃度并計(jì)算解吸率,建立解吸率與時(shí)間的靜態(tài)解吸附動(dòng)力學(xué)曲線。

1.2.4.3 大孔樹(shù)脂靜態(tài)吸附及解吸附條件優(yōu)化 使用篩選出的DA-201依照方法1.2.4.1及1.2.4.2進(jìn)行靜態(tài)吸附和靜態(tài)解吸附實(shí)驗(yàn),研究樹(shù)脂靜態(tài)吸附和解吸附動(dòng)力學(xué),考察樣液質(zhì)量濃度(0.1、0.3、0.7、1.4、2.8 mg/mL,pH為4.0)和pH(2、3、4、5、6,樣液質(zhì)量濃度為0.7 mg/mL)對(duì)靜態(tài)吸附的影響,乙醇濃度(75%、80%、85%、90%、95%,pH為4.0,樣液質(zhì)量濃度為0.7 mg/mL)對(duì)靜態(tài)解吸附的影響。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次取平均值。

1.2.4.4 樹(shù)脂吸附率及解吸率的計(jì)算 吸附量(Q)、吸附率(E)、解吸率(D)、回收率(R)分別按照如下公式計(jì)算[21]。

式(1)

式(2)

式(3)

式(4)

式中:C0-溶液總黃酮起始濃度,mg·mL-1;Ce-溶液平衡時(shí)黃酮濃度,mg·mL-1;V0-吸附液體積,mL;m-樹(shù)脂質(zhì)量,g;Cd-解吸液黃酮濃度,mg·mL-1;Vd-解吸液體積,mL。

1.2.5 景天三七總黃酮抗氧化活性測(cè)定

1.2.5.1 景天三七精提液樣品的制備 按1.2.4優(yōu)化試驗(yàn)得到的DA-201型樹(shù)脂純化分離條件處理景天三七總黃酮樣品液,收集洗脫液,離心(4500 r/min,15 min,25 ℃),濃縮除醇,進(jìn)行預(yù)凍過(guò)夜(0 ℃)后置于真空冷凍干燥機(jī)中干燥36 h得景天三七精提物總黃酮粉末。按照方法1.2.1配制成景天三七精提物溶液,比較純化前后的黃酮純度和抗氧化活性。

1.2.5.2 總黃酮純度的測(cè)定 總黃酮溶液理論濃度值為1.00 mg·mL-1(P2),測(cè)定粗提物及精提物液樣品純度(P1),計(jì)算含量。按式(5)計(jì)算含量(P)。

式(5)

式中:P1-溶液實(shí)際濃度,mg·mL-1;P2-溶液理論濃度,mg·mL-1。

1.2.5.3 DPPH·清除作用測(cè)定 參考Helal等[22]對(duì)DPPH·清除率測(cè)定方法,于517 nm下測(cè)定吸光值,按下式(6)計(jì)算DPPH·清除率(K)。以VC作為陽(yáng)性對(duì)照。

式(6)

式中:Ai-加入樣品溶液吸光值;Aj-樣品溶液本底吸光值;Ac-空白吸光值。

1.2.5.4 ABTS+·清除活性 以過(guò)硫酸鉀溶液配制ABTS+儲(chǔ)備液,并以磷酸鹽緩沖液稀釋得到ABTS+·測(cè)定液,參照Binsan等[23]的方法,按下式(7)計(jì)算ABTS+·自由基清除率。以VC作為陽(yáng)性對(duì)照。

式(7)

式中:Ai-加入樣品溶液吸光值;Aj-樣品溶液本底吸光值;Ac-空白吸光值。

1.2.5.5 對(duì)羥基自由基清除作用測(cè)定 參照薛丁萍等[24]對(duì)羥自由基的測(cè)定方法,按下式(8)計(jì)算羥自由基清除率(R)。以VC作為陽(yáng)性對(duì)照。

式(8)

式中:Ai-加入樣品溶液吸光值;Aj-樣品溶液本底吸光值;Ac-空白吸光值。

1.2.6 景天三七總黃酮純化物初步鑒定

1.2.6.1 紫外-可見(jiàn)光譜掃描 用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),于250～600 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)對(duì)景天三七總黃酮純化液進(jìn)行紫外-可見(jiàn)光譜掃描分析。

1.2.6.2 紅外光譜掃描 取適量景天三七總黃酮純化物粉末,與適量的溴化鉀研磨混合后壓片,在400～4000 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行紅外光譜掃描。

1.2.6.3 顏色反應(yīng) 采用鹽酸-鋅粉反應(yīng)、四氫硼鈉反應(yīng)、鋁鹽反應(yīng)、鎂鹽反應(yīng)、與濃硫酸反應(yīng)[25],觀察并記錄顏色,對(duì)景天三七總黃酮的種類(lèi)進(jìn)行初步鑒定。

1.2.6.4 HPLC-MS分析 供試品溶液制備:取景天三七精提物總黃酮粉末0.1 g,置50 mL容量瓶中,加入70%乙醇40 mL,超聲處理30 min,放至室溫,用70%乙醇定容。搖勻后取適量離心5 min(12000 r/min),取上清液,即得。

色譜條件:色譜柱為ZorbaxEclipseXDB-C18(4.6×250 mm,5 μm);柱溫40 ℃;進(jìn)樣量50 μL;檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm;流速0.63 mL/min。流動(dòng)相A:水;流動(dòng)相B:甲醇。洗脫程序:0 min,0 A;5 min,20% A;10 min,40% A;15 min,80% A;20 min,95% A。質(zhì)譜條件:采用ESI源,負(fù)離子模式,離子掃描范圍0～1000 m/z;霧化氣壓力:207 kPa;干燥氣流速:10 L/min;干燥氣溫度:325 ℃;TrapICC:30,000 units;最大累計(jì)時(shí)間:300 ms;MS誘導(dǎo)碰撞能量為1.0 V。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)均平行重復(fù)3次,采用Excel,SPSS 23軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,使用Origin 8.5處理數(shù)據(jù)和繪圖;紅外、紫外、色譜圖、質(zhì)譜圖由儀器自帶系統(tǒng)給出。

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔樹(shù)脂對(duì)景天三七總黃酮靜態(tài)吸附解吸優(yōu)化

2.1.1 大孔樹(shù)脂篩選 在相同靜態(tài)吸附試驗(yàn)條件下,測(cè)得各樹(shù)脂對(duì)景天三七總黃酮的靜態(tài)吸附-解吸附結(jié)果如表1所示。

表1 不同大孔吸附樹(shù)脂對(duì)景天三七總黃酮靜態(tài)吸附和解吸結(jié)果Table 1 Static adsorption and desorption of total flavonoids from different macroporous

通常對(duì)大孔樹(shù)脂吸附作用影響較大的因素有極性、樹(shù)脂孔徑、比表面積等。由表1可知,所選取的4種大孔樹(shù)脂對(duì)景天三七總黃酮均有一定的吸附量,且相互之間差異性顯著(p<0.05),DA-201的吸附量、吸附率、解吸率、回收率均高于其它類(lèi)型樹(shù)脂。推測(cè)所選樹(shù)脂的極性和目標(biāo)物極性越相近,DA-201屬于極性共聚體,與黃酮類(lèi)化合物極性相似,因此其具有較強(qiáng)的吸附能力。雖然X-5和AB-8型樹(shù)脂孔徑和比表面積大更有利于解吸過(guò)程,但可能因其極性原因,其吸附率較DA-201型低。綜合各方面因素,最終選用DA-201型大孔樹(shù)脂作進(jìn)一步研究。

2.1.2 大孔樹(shù)脂靜態(tài)吸附-解吸附動(dòng)力學(xué)曲線 由圖1、圖2可知,DA-201型大孔樹(shù)脂的吸附率和解吸率在對(duì)景天三七總黃酮的吸附-解吸附的過(guò)程中,隨時(shí)間的增加而分別相應(yīng)增長(zhǎng),吸附率在1 h后維持在相對(duì)平穩(wěn)的狀態(tài),解吸附率在3 h后趨于平穩(wěn),所以從實(shí)際生產(chǎn)的角度考慮,1 h為最適宜吸附時(shí)間,3 h為最適宜的解吸附時(shí)間。

圖1 DA-201樹(shù)脂靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線Fig.1 Static adsorption kinetic curve of DA-201 resin

圖2 DA-201樹(shù)脂靜態(tài)解吸附動(dòng)力學(xué)曲線Fig.2 Static desorption kinetic curve of DA-201 resin

2.1.3 樣液質(zhì)量濃度對(duì)DA-201樹(shù)脂吸附率的影響 由圖3可知,DA-201樹(shù)脂吸附率隨樣液質(zhì)量濃度的升高不斷提升,但在樣液質(zhì)量濃度增加至0.7 mg/mL后,上升趨勢(shì)近于平穩(wěn)。在樣液濃度較低時(shí),樣液中的黃酮分子和DA-201樹(shù)脂的接觸幾率較小,所以吸附率低;當(dāng)樣液質(zhì)量濃度持續(xù)增加后,DA-201樹(shù)脂的孔徑已經(jīng)處于填充飽和狀態(tài),繼續(xù)提升樣液質(zhì)量濃度對(duì)其吸附率起不到提升作用。考慮吸附效率,所以樣液質(zhì)量濃度選用0.7 mg/mL為宜。

圖3 樣液質(zhì)量濃度對(duì)DA-201樹(shù)脂吸附率的影響Fig.3 Effect of mass concentration of liquid sample on adsorption rate of DA-201 resin

2.1.4 樣液pH對(duì)DA-201樹(shù)脂吸附率的影響 由圖4可知,隨樣液pH的升高,DA-201樹(shù)脂吸附率逐漸降低,在pH為2～3時(shí)吸附率呈緩慢下降趨勢(shì)。依據(jù)大孔樹(shù)脂的吸附原理,樣液pH應(yīng)當(dāng)接近吸附目標(biāo)物的酸堿度時(shí),吸附效果最好,但pH過(guò)低時(shí)易對(duì)黃酮類(lèi)化合物產(chǎn)生破壞作用,導(dǎo)致分解變性等。因此雖然黃酮類(lèi)化合物多為酸性或弱酸性的酚類(lèi)物質(zhì),但實(shí)際采用pH=3為最佳條件。

圖4 樣液pH對(duì)DA-201樹(shù)脂吸附率的影響Fig.4 Effect of sample solution pH on adsorption rate of DA-201 resin

2.1.5 乙醇濃度對(duì)樹(shù)脂靜態(tài)解吸附的影響 由圖5可知,當(dāng)乙醇濃度為90%時(shí),景天三七總黃酮的解吸率達(dá)到最高。因?yàn)辄S酮類(lèi)化合物多易溶于乙醇,乙醇濃度越高,黃酮類(lèi)物質(zhì)溶解程度越高,但由于有解吸液中其余醇溶性雜質(zhì)的存在,當(dāng)乙醇濃度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致其雜質(zhì)解吸增多,降低黃酮類(lèi)化合物的吸附率。故乙醇濃度選擇90%為宜。

圖5 乙醇濃度對(duì)DA-201樹(shù)脂解吸率的影響Fig.5 Effect of ethanol concentration on the desorption rate of DA-201 resin

2.2 景天三七總黃酮純化前后的抗氧化活性

對(duì)景天三七總黃酮經(jīng)DA-201型大孔樹(shù)脂純化前后的總黃酮純度進(jìn)行對(duì)比,并通過(guò)IC50(50%清除率)作為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)ABTS清除率、羥自由基、DPPH清除率三個(gè)指標(biāo)進(jìn)行純化前后的體外抗氧化能力對(duì)比分析。IC50值可通過(guò)SPSS 23軟件對(duì)圖6中的清除率曲線進(jìn)行回歸分析擬合處理,結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知,經(jīng)DA-201型大孔樹(shù)脂純化后,總黃酮的純度由19.38%提高到43.78%,景天三七總黃酮純度提升了2.26倍,且羥自由基、DPPH清除率的IC50均低于純化前,IC50值越低,說(shuō)明樣品抗氧化性越強(qiáng)。單方方等人[26]在對(duì)牡丹葉的黃酮類(lèi)化合物純化對(duì)抗氧化能力影響研究時(shí),同樣發(fā)現(xiàn)黃酮純度越高抗氧化效果越明顯。所以DA-201型大孔樹(shù)脂對(duì)景天三七總黃酮純化效果整體突出,較大程度上提升了景天三七總黃酮的純度和體外抗氧化活性,可以為下一步的景天三七總黃酮性質(zhì)研究提供適宜樣品。

表2 純化前后景天三七總黃酮純度、體外抗氧化能力比較Table 2 Comparison of purity and antioxidant capacity of total flavones of Sedum aizoon before and after purification

圖6 景天三七總黃酮體外抗氧化作用Fig.6 Antioxidant activity of total flavonoids from Sedum aizoon in vitro注:(a)～(c)分別為ABTS自由基清除率、 羥自由基清除率和DPPH自由基清除率。

2.3 景天三七總黃酮性質(zhì)初步鑒定

2.3.1 紫外可見(jiàn)吸收光譜分析 通常大多數(shù)黃酮類(lèi)化合物的紫外可見(jiàn)吸收光譜由峰帶I(300～350 nm,產(chǎn)生于黃酮類(lèi)化合物基本結(jié)構(gòu)中的環(huán)苯甲酰系統(tǒng))和峰帶II(350～400 nm,產(chǎn)生于黃酮類(lèi)化合物基本結(jié)構(gòu)中的環(huán)肉桂酰系統(tǒng))兩部分組成。)對(duì)樣品溶液在250～600 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外-可見(jiàn)光譜掃描。結(jié)果如圖7所示,景天三七總黃酮的吸收波長(zhǎng)主要分為兩個(gè)吸收帶,峰帶I的吸收峰在350～390 nm間,峰帶II的吸收峰位于270 nm,符合黃酮醇類(lèi)化合物吸收峰帶的特征,峰帶II的吸收峰強(qiáng)度明顯強(qiáng)于峰帶I,并且峰帶I峰型較寬、平緩,可能是因?yàn)榄h(huán)苯甲酰系統(tǒng)上取代基成分種類(lèi)較多。

圖7 景天三七總黃酮的紫外-可見(jiàn)吸收光譜圖Fig.7 UV Vis absorption spectra of total flavonoids from Sedum aizoon

2.3.2 紅外可見(jiàn)吸收光譜分析 由圖8可知,費(fèi)總黃酮樣品和蘆丁在400～4000 cm-1范圍內(nèi)出現(xiàn)多處波峰。其中,標(biāo)準(zhǔn)品蘆丁在3427 cm-1和樣品在3432 cm-1處的寬大且強(qiáng)度極高的吸收峰均為游離O-H伸縮振動(dòng)的吸收峰,說(shuō)明了酚羥基的存在;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的2935 cm-1和樣品的2920 cm-1,為-CH2的反對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)峰[27];在1650～1450 cm-1區(qū),是蘆丁的苯環(huán)骨架震動(dòng)特征吸收峰分布區(qū)域,此處景天三七總黃酮樣品和蘆丁一致具有三個(gè)吸收峰,可推測(cè)樣品可能有苯環(huán)的存在;在1500～1300-1cm-1處,蘆丁和樣品都出現(xiàn)一定特征峰,這是O-H的面內(nèi)彎曲振動(dòng)峰;C-O的伸縮振動(dòng)吸收峰位是1300～1200 cm-1,蘆丁和樣品在此區(qū)域都有相應(yīng)的特征峰;蘆丁和樣品位于573 cm-1處的吸收峰是苯環(huán)上的取代基引起的,樣品此處的吸收峰強(qiáng)度低于蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品,表明羥基取代位置不同[28]。依據(jù)上述基于吸收譜帶的位置及對(duì)官能團(tuán)推測(cè)的信息,景天三七總黃酮與蘆丁的紅外光譜有多處相似,初步判斷景天三七總黃酮可能為黃酮醇,但具體的結(jié)構(gòu)還需要進(jìn)一步的研究與探索。

圖8 景天三七總黃酮和標(biāo)準(zhǔn)品蘆丁的紅外光譜圖Fig.8 Infrared spectrum of total flavones and standard Rutin of Sedum aizoon

2.3.3 顏色反應(yīng)鑒定分析 對(duì)純化后的景天三七總黃酮進(jìn)行顏色反應(yīng),結(jié)果見(jiàn)表3。通過(guò)顏色反應(yīng)結(jié)果,結(jié)合文獻(xiàn)[29]報(bào)道,對(duì)景天三七總黃酮的性質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步鑒定分析,初步推測(cè)為黃酮醇類(lèi)化合物。

表3 景天三七總黃酮顏色反應(yīng)結(jié)果及分析Table 3 Results and analysis of the color reaction of the total flavonoids of Sedum aizoon

此結(jié)果也與紫外-可見(jiàn)光譜掃描和紅外光譜掃描的結(jié)果一致。

2.3.4 HPLC-MS信息分析 由于純化后的樣品是仍含有一部分雜質(zhì)的混合物,且成分復(fù)雜未知,對(duì)質(zhì)譜信息造成一定的干擾,本研究決定采用低分辨質(zhì)譜儀對(duì)純化后的樣品進(jìn)行初步的物質(zhì)推測(cè),以期為后續(xù)景天三七黃酮類(lèi)化合物分級(jí)分離定性研究作一定參考。

如圖9總離子流圖,各峰分離效果較好,對(duì)其中主要的6個(gè)峰的質(zhì)譜信息進(jìn)行推斷,依據(jù)特征碎片離子峰的質(zhì)荷比結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道的黃酮類(lèi)化合物信息[30-31],從而可以初步推測(cè)樣品中可能含有的黃酮化合物,結(jié)果如表4所示,可能主要存在的黃酮類(lèi)化合物有蕓香糖苷、水飛薊素類(lèi)、蘆丁類(lèi)、金絲桃苷類(lèi)、山奈酚-3-O-糖苷類(lèi)、槲皮素-3-O-糖苷類(lèi)。

圖9 景天三七純化后總黃酮樣品負(fù)總離子流色譜圖Fig.9 Total negative ion chromatograms of total flavonoids after purification

圖10 代表化合物的質(zhì)譜圖Fig.10 Mass spectrum of the represents compound 注:圖(a)～(f)分別為1～6代表化合物一級(jí)質(zhì)譜圖。

表4 代表化合物質(zhì)譜數(shù)據(jù)Table 4 Mass spectrometry data representative compound

3 結(jié)論

通過(guò)靜態(tài)吸附解吸附實(shí)驗(yàn),篩選出DA-201型大孔吸附樹(shù)脂為最佳樹(shù)脂類(lèi)型,且獲得DA-201型大孔吸附樹(shù)脂最佳靜態(tài)吸附分離工藝參數(shù)為:吸附時(shí)間3 h,樣液質(zhì)量濃度為0.7 mg/mL,上樣液pH為3.0,解吸附乙醇濃度為90%。在該條件下靜態(tài)吸附率為81.05%,解吸附率為86.05%。純化后,總黃酮的純度由19.38%提高到43.78%,其羥自由基、DPPH清除率的IC50分別由69.47、44.02 μg/mL下降到43.25、30.16 μg/mL,純化后的純度和抗氧化能力明顯提升。通過(guò)紫外可見(jiàn)光譜、紅外光譜、顏色反應(yīng)等一系列性質(zhì)鑒定分析方法,初步推測(cè)本文所研究的純化后的景天三七總黃酮中可能含有蕓香糖苷、水飛薊素類(lèi)、蘆丁、金絲桃苷類(lèi)、山奈酚-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-糖苷類(lèi)等化合物,具體的成分組成及結(jié)構(gòu)分析有待進(jìn)一步研究。