均勻設(shè)計法優(yōu)化葛根素白蛋白微球處方工藝

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(1.桂林醫(yī)學院藥學院，廣西桂林 541004； 2.廣西中醫(yī)藥大學藥學院，廣西南寧 530200)

葛根是我國一種較為常見的中藥，其提取物中含有淀粉、纖維素、異黃酮類等成分[1-3]，具有較高的藥用價值，葛根也可以作為一種常用的食品，具有一定的保健作用[3-4]。葛根素為異黃酮類化合物，是中藥材葛根提取物中的主要活性成分[5]，具有增加冠狀動脈血流量、保護心肌缺血細胞、改善微循環(huán)，抗血小板聚集，降低心肌耗氧量等多種藥理作用[6-7]，被廣泛應(yīng)用于心腦血管疾病和免疫系統(tǒng)疾病的臨床治療之中[1,8]。但其水溶性差、半衰期短、口服生物利用度低[8-10]，達不到很好的治療效果，嚴重限制了葛根素的臨床應(yīng)用，因此，開發(fā)一種具有高效生物利用度的葛根素新劑型具有重要的現(xiàn)實意義。

牛血清白蛋白是一種天然的高分子材料，其化學性質(zhì)穩(wěn)定、無毒、可生物降解[11]，作為藥物載體受到廣泛關(guān)注，常應(yīng)用于微球、納米粒等劑型的制備。牛血清白蛋白微球是以牛血清白蛋白作為載體而制得的一種微米級制劑，可將藥物包裹于白蛋白的網(wǎng)狀空隙中[12]，利用白蛋白將難溶性藥物制備成微球，不僅可以使藥物的溶解度增加，還可以保護藥物不受外界環(huán)境影響，從而提高藥物的生物利用度[13-14]。白蛋白微球是近年來靶向劑型的研究熱點，作為控制藥物釋放的新型載體給藥系統(tǒng)，還具有緩釋性、靶向性，可減少給藥次數(shù)，降低病患痛苦，使藥物在病變組織釋藥，提高藥物有效濃度，減少對人體組織器官的損害和不良反應(yīng)的發(fā)生[15]。

由于藥物性質(zhì)的差異性，制備白蛋白微球的方法也有所不同，如三七總皂苷白蛋白微球采用加熱固化法進行制備，而多西他賽白蛋白微球則采用乳化-化學交聯(lián)法[16-17]。本實驗以葛根素為模型藥物，牛血清白蛋白微球為載體，采用乳化熱固化法制備葛根素白蛋白微球，并通過均勻設(shè)計試驗對微球制備工藝進行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

葛根素對照品 純度95.5%，中國食品藥品檢定研究院；牛血清白蛋白 純度>98%，北京索萊寶生物科技有限公司；75%葛根素 康元醫(yī)藥科技有限公司；司盤80 麥克林；液體石蠟、乙醚 西隴科學股份有限公司。

UV-2550紫外分光光度計 日本島津公司；DF-101S磁力攪拌器 邦西儀器科技有限公司；CX22RFS1光學顯微鏡 奧林巴斯；SCIENTZ-IID超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技有限股份公司；P60H超聲波清洗器 德國elma公司；HC-3618R高速冷凍離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 葛根素白蛋白微球的制備 精密稱取一定量的葛根素、牛血清白蛋白溶于3 mL水溶液中，超聲(37 kHz，5 min)溶解。將上述混勻的混合溶液全部吸入注射器內(nèi)，緩慢注入60 ℃、5 mL液體石蠟與一定量的司盤80混合，置磁力攪拌器1000 r/min高速攪拌10 min，形成初乳；另取15 mL液體石蠟，油浴加熱至120 ℃，將上述初乳在攪拌下緩緩加入，恒溫攪拌固化30 min后，冷卻至室溫，3000 r/min離心10 min，傾去上清液分離微球，沉淀物用乙醚洗滌3～4次，靜置揮發(fā)乙醚，冷凍干燥得載藥微球[18]。

1.2.2 單因素試驗 考察牛血清白蛋白、葛根素及乳化劑司盤80添加量對微球包封率和載藥量的影響。

1.2.2.1 牛血清白蛋白用量的考察 固定葛根素加入量為20 mg，乳化劑司盤80為0.5 mL，牛血清白蛋白分別取0.1、0.2、0.3、0.4 g，制備微球；

1.2.2.2 葛根素用量的考察 固定牛血清白蛋白用量為0.2 g，乳化劑司盤80為0.5 mL，葛根素分別取10、20、30、40 mg，制備微球；

1.2.2.3 乳化劑司盤80用量的考察 固定葛根素加入量為20 mg，牛血清白蛋白用量0.2 g，乳化劑司盤80分別取0.2、0.3、0.5、0.8 mL，制備微球。

1.2.3 均勻設(shè)計試驗 以牛血清白蛋白用量、葛根素加入量、司盤80用量為考察因素，見表1。通過U9(96)均勻設(shè)計試驗優(yōu)選最佳處方工藝，在Design-Expert軟件中選擇設(shè)計類型(Design type)為歷史數(shù)據(jù)(Historical data)，對數(shù)據(jù)進行二次曲面方程響應(yīng)面分析[19]。

表1 因素與水平Table 1 Factors and levels

1.2.4 指標的測定

1.2.4.1 葛根素標準曲線的繪制 根據(jù)葛根素甲醇溶液紫外掃描圖譜，選定248 nm為檢測波長。精密稱取葛根素對照品5 mg于50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得含量為0.1 mg/mL的葛根素對照品溶液。分別精密吸取不同量的對照品溶液稀釋成濃度分別為3.0、4.5、6.0、7.5、9.0 μg·mL-1的標準溶液。以甲醇溶液作為空白對照，用紫外分光光度計在248 nm處測定其吸光值Y，再以溶液濃度X為橫坐標，吸光值Y為縱坐標，繪制出標準曲線。根據(jù)葛根素標準曲線測定結(jié)果，得到其線性回歸方程：Y=0.0836X+0.0106，決定系數(shù)R2=0.9993。實驗結(jié)果表明，葛根素的濃度在3.0～9.0 μg·mL-1與吸光值呈現(xiàn)良好線性關(guān)系。

1.2.4.2 包封率和載藥量的測定 精密稱取微球粉末10.00 mg于研缽中，加入甲醇研磨，研磨至在顯微鏡觀察到微球結(jié)構(gòu)被破壞即可，于超聲波細胞粉碎機中50 ℃、150 W超聲處理5 min，冷卻至室溫，微孔濾膜過濾，將濾液轉(zhuǎn)移到50 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，在248 nm下用紫外分光光度計測其吸光值，根據(jù)標準曲線計算微球中葛根素含量，按下列公式計算載藥量和包封率[20-21]。

載藥量(%)=(微球中的葛根素質(zhì)量/微球粉末質(zhì)量)×100

包封率(%)=(微球中的葛根素質(zhì)量/投藥量)×100

投藥量=葛根素用量×葛根素的純度

1.2.4.3 綜合評分的確定 以微球的載藥量、包封率為指標進行綜合評分。評分方法：各指標均以最大值作為參照，所得數(shù)據(jù)經(jīng)歸一化處理后結(jié)合權(quán)重系數(shù)計算綜合分值[17]，綜合評分=(包封率/包封率的最大值×0.5+載藥量/載藥量的最大值×0.5)。

1.2.5 微球形態(tài)觀察 將少量微球粉末置于載玻片上并用適量純凈水稀釋分散，在光學顯微鏡下觀察所制微球的形態(tài)[16]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 牛血清白蛋白用量對包封率與載藥量的影響 牛血清白蛋白用量對葛根素白蛋白微球包封率與載藥量的影響如圖1所示，隨著牛血清白蛋白用量的增加，包封率與載藥量先上升后下降，說明牛血清白蛋白用量在一定范圍內(nèi)能夠提高微球的包封率與載藥量，當使用量為0.2 g時，包封率與載藥量最大，分別為67.36%、6.92%，但是當使用量超過0.2 g時，包封率與載藥量均呈下降趨勢，這是由于牛血清白蛋白具有表面活性劑的作用，如果表面活性劑的濃度過大，在微球形成過程中會過早的吸附在微球表面，導致包封率與載藥量降低[14]，所以選擇牛血清白蛋白用量在0.1～0.3 g范圍內(nèi)。

圖1 牛血清白蛋白用量對包封率與載藥量的影響Fig.1 Effect of Bovine Serum Albumin dosage on entrapment efficiency and drug loading

2.1.2 葛根素用量對包封率與載藥量的影響 如圖2所示，葛根素小于30 mg時，隨著用量的增加，包封率與載藥量逐漸提高；當使用量為30 mg時，包封率與載藥量最大，分別為74.12%、7.89%，當使用量超過30 mg時，包封率與載藥量均下降，且微球成型性變差，葛根素用量在10～30 mg范圍內(nèi)較合適。

圖2 葛根素用量對包封率與載藥量的影響Fig.2 Effect of puerarin dosage on entrapment efficiency and drug loading

2.1.3 乳化劑司盤80用量對包封率與載藥量的影響 由圖3可知，隨著司盤80用量的增加，包封率與載藥量呈現(xiàn)出先增加后減少的趨勢，當司盤80用量為0.3 mL時，包封率與載藥量最大，分別為72.49%、7.54%，說明司盤80用量在一定范圍內(nèi)能夠提高葛根素白蛋白微球的包封率與載藥量，所以選擇司盤80用量在0.3～0.8 mL范圍內(nèi)。

圖3 司盤80用量對包封率與載藥量的影響Fig.3 Effect of span-80 dosage on entrapment efficiency and drug loading

2.2 均勻設(shè)計法試驗

表3 回歸方程方差分析表Table 3 Analysis of variance for the regression equation

表2 均勻設(shè)計表及處方測定結(jié)果 Table 2 Factors with coded values for uniform design and formulation measure results

2.3 微球的形態(tài)

取優(yōu)化處方工藝制得的微球粉末適量，置于顯微鏡下觀察其形態(tài)(見圖4)，可見微球外觀圓整，大小均勻，無黏連。

圖4 葛根素白蛋白微球光學顯微鏡照片(40×)Fig.4 Light micrograph of puerarin albumin microspheres(40×)

3 討論與結(jié)論

白蛋白微球的制備方法主要有乳化固化法、去溶劑法、聚合法等，本文采用乳化熱固化法制備微球，其中葛根素加入量對微球成型有較大影響，當葛根素用量達到一定程度時，制得的微球會出現(xiàn)明顯的黏連現(xiàn)象，原因可能是載體牛血清白蛋白所能包裹的葛根素已經(jīng)飽和，過量的葛根素使微球發(fā)生黏連[22]，與文獻[18]報道的結(jié)果一致。在微球制備過程中，牛血清白蛋白濃度也會影響到葛根素的包封率與載藥量，可能是隨著牛血清白蛋白用量的增加，最初藥物均能被有效包裹，所以包封率和載藥量提高，但當其濃度達到一定值后，在微球形成過程中使其過早的吸附在微球表面，從而導致較低的包封率與載藥量[14]。實驗曾嘗試使用乳化化學固化法制備白蛋白微球，但其制得的微球成型性差，重現(xiàn)性差，且交聯(lián)劑戊二醛具有一定細胞毒性以及變應(yīng)原性[23]。

本研究在單因素及預(yù)實驗的基礎(chǔ)上，以包封率、載藥量為指標，選取了影響較大的3個因素，牛血清白蛋白用量、藥物葛根素用量與乳化劑司盤80用量進行3因素3水平的均勻設(shè)計試驗，得最優(yōu)處方：牛血清白蛋白為0.20 g，葛根素為30.00 mg，司盤80為0.80 mL，并根據(jù)最優(yōu)處方驗證了5批處方，載藥量與包封率分別為9.81%±0.14%、76.75%±2.09%，與單因素試驗相比，載藥量與包封率均有所提高，以優(yōu)化工藝制備的葛根素白蛋白微球外觀為白色粉末，流動性良好。通過優(yōu)化后的工藝，可獲得較為理想的葛根素白蛋白微球。