蛋清抗氧化肽分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定

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(天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院,天津 300457)

中國是禽蛋生產(chǎn)大國,目前國內(nèi)市場上的蛋制品主要是全蛋粉、蛋清粉、蛋黃粉以及蛋液等低附加值產(chǎn)品。蛋白被認(rèn)為是豐富的蛋白質(zhì)具有豐富生物活性的多肽組分。蛋中含有人體必需氨基酸,蛋白質(zhì)模型與人類蛋白質(zhì)模型最為相似,蛋清中蛋白質(zhì)含量約為11%～15%,主要包括卵清蛋白、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白、溶菌酶、卵粘蛋白、卵清蛋白和抗生物素蛋白[1-3]。但目前禽蛋加工水平較低,原料生產(chǎn)較分散,禽蛋量雖然大,但是深加工產(chǎn)品較少,且加工技術(shù)落后,科技研發(fā)產(chǎn)品較少[4-5]。

生物活性肽基于固有的氨基酸組成和序列,通常含有2～20個(gè)氨基酸殘基,是特定的蛋白質(zhì)片段。生物活性肽在親本蛋白質(zhì)序列內(nèi)無活性,可在蛋白水解或發(fā)酵過程中釋放,并通過影響消化系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)人體健康產(chǎn)生重要作用[6]。從動(dòng)物蛋白釋放的幾種肽已經(jīng)被證實(shí)具有一系列的功能活性,包括血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性[7]、抗血栓形成[8]、抗高血壓性[9]、抗氧化作用[10]、抗菌性、阿片樣活性、細(xì)胞與免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)[11]、降膽固醇性質(zhì)、抗肥胖和抗基因毒性等活性[12-14]。

目前,關(guān)于活性肽的分離純化較多采用的是凝膠過濾層析、離子交換樹脂、超濾、高效液相、電泳等方法[15]。各種分離技術(shù)在生產(chǎn)過程中協(xié)同發(fā)展、技術(shù)聯(lián)用、取長補(bǔ)短、實(shí)行多級(jí)分離是生物活性肽分離純化的發(fā)展趨勢。其中超濾、離子交換層析、凝膠過濾層析由于其分離條件溫和、產(chǎn)品回收率高、生物活性好、操作方便而廣泛應(yīng)用于多肽的分離純化。如程云輝等[16]采用截留相對(duì)分子質(zhì)量3 kDa的聚砜膜對(duì)麥胚蛋白酶解物進(jìn)行了超濾分離,其抗氧化活性得到了顯著提高。Ye等[17]以強(qiáng)陽離子交換填料為固定相分離小分子肽段,發(fā)現(xiàn)由2～8個(gè)氨基酸組成寡肽的分離峰峰形尖銳且分辨率很高。鐘芳等[18]使用葡聚糖凝膠G-15純化大豆蛋白源高活性酪蛋白血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽,其水解物的ACE抑制率從56.53%升至69.57%。

本研究以蛋清蛋白粉為原料,通過酶解法制備蛋清低聚肽,同時(shí)采用超濾、離子交換層析、凝膠層析常規(guī)方式對(duì)蛋清低聚肽進(jìn)行分離純化,同時(shí)采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)所得多肽進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定,同時(shí)研究蛋清肽中抗氧化肽的活性及其結(jié)構(gòu),為蛋清肽的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蛋清蛋白粉 天津太陽食品有限公司;堿性蛋白酶(酶活102161.8 U/g) 山東欣鼎生物科技有限公司;001×7強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂 北京索萊寶科技有限公司;葡聚糖凝膠Sephadex G-25 北京索萊寶科技有限公司;氫氧化鈉 分析純,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;DPPH 分析純,美國Sigma公司;磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉 分析純,天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司;龍膽酸2,5-二羥基苯甲酸 北京索萊寶科技有限公司。

DBS全自動(dòng)部份收集器 上海生析超聲儀器有限公司;752PC型紫外可見分光光度計(jì) 天津市普瑞斯儀器有限公司;MODEL808型酸度計(jì) 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;Vizared 2.0型真空冷凍干燥機(jī) 美國VirTris公司;Autoflex speed基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜 沃特世科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蛋清肽的制備 用去離子水將蛋白粉配制成3%的蛋白溶液,95 ℃水浴鍋下預(yù)熱處理15 min,調(diào)制最適酶解溫度57 ℃,保溫處理10 min,將溶液調(diào)至最適pH8,加入4000 U/g堿性蛋白酶200 r/min恒溫酶解,反應(yīng)過程中,需不斷加入1 mol/L的氫氧化鈉保證pH恒定在8,酶解結(jié)束后95 ℃水浴滅酶處理15 min,冷卻到室溫4000 r/min離心15 min,上清液即為酶解液EWPH,真空冷凍干燥(0.37 Mpa,-80 ℃)12 h,凍干后置于干燥器備用[19]。

1.2.2 DPPH自由基清除能力測定 參考文獻(xiàn)[20]方法并略作修改,配制蛋清肽濃度為2、4、6、8、10 mg/mL,分別取2 mL溶液加入0.1 mmol/L的DPPH溶液2 mL混合均勻,避光反應(yīng)0.5 h,于517 nm處測定吸光度A1,分別測定等量溶液與等量無水乙醇、等量無水乙醇和等量等濃度DPPH混合溶液在相同條件下的吸光度A2、A3。DPPH自由基清除率計(jì)算公式如下:

1.2.3 膜超濾法分離純化蛋清肽 采用截留分子量分別為10 kDa和3 kDa的超濾離心管，對(duì)經(jīng)1.2.1制備的蛋清肽溶液進(jìn)行分級(jí)分離(4000 r/min,15 min),所得各組分分子量大于10 kDa的EWPH-I,分子量約3～10 kDa的EWPH-II,及分子量小于3 kDa的EWPH-III。并將各組分于1.2.1相同條件下凍干并分析其DPPH自由基清除能力。

1.2.4 離子交換動(dòng)態(tài)柱層析分離純化 將超濾法分離所得的抗氧化活性最強(qiáng)的組分溶于pH6.0 0.05 mol/L的醋酸銨緩沖液，配制成濃度為20 mg/mL的溶液,利用相同醋酸銨緩沖液平衡001×7強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂裝柱12 h。柱子平衡后,上樣體積5 mL,吸附時(shí)間1 h,以0.2 mol/L氨水1.0 mL/min等速洗脫,并以3 mL/管收集洗脫液,于215 nm下檢測吸光值[21],將屬于同一峰的洗脫液收集在一起冷凍干燥,與1.2.1相同條件下凍干并分析其DPPH自由基清除能力。

1.2.5 凝膠層析法分離純化 離子交換層析法分離所得的抗氧化活性最強(qiáng)的組分溶于pH7.0 0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液中配制成20 mg/mL的溶液。用相同緩沖液平衡Sephadex G-25葡聚糖凝膠樹脂柱12 h。以下操作與1.2.4相同,將所得組分凍干并分析其DPPH自由基清除能力。

1.2.6 MALDI-TOF質(zhì)譜分析抗氧化肽 將經(jīng)兩步純化后的樣品和基質(zhì)龍膽酸2,5-二羥基苯甲酸(DHB)1∶1混合,取1 μL點(diǎn)在MALDI不銹鋼靶板上,室溫下自然干燥。另點(diǎn)1 μL DHB溶液(未點(diǎn)樣品)作為空白對(duì)照。激光源為355 nm的Nd YAG激光器,加速電壓為20 kV,采用正離子模式和自動(dòng)獲取數(shù)據(jù)的模式采集數(shù)據(jù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Office Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以3次重復(fù)的“均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的差異性分析,采用Origin 9.0繪制圖像。

2 結(jié)果與分析

2.1 超濾純化EWPH對(duì)其抗氧化活性影響

酶解液經(jīng)超濾后,得到三個(gè)組分:EWPH-I(Mw>10 kDa)、EWPH-II(3 kDa

圖1 蛋清蛋白肽不同超濾組分 對(duì)DPPH自由基的清除作用Fig.1 DPPH scavenging activity of different UF fractions of protein peptide注:誤差線右側(cè)不同小寫字母表示差異性顯著(p<0.05)。

2.2 離子交換層析分離純化EWPH-III

圖2 離子交換色譜分離EWPH-IIIFig.2 Separation of the EWPH-III by ion-exchange chromatography

組分餾分DPPH自由基清除率(%)A79.86±0.76aB82.05±1.21a

2.3 葡聚糖凝膠樹脂分離純化EWPH-III-B

如圖3,得到C、D、E、F 4個(gè)組分峰,其DPPH自由基清除率分別為83.63%、85.26%、88.49%、87.62%(p<0.5)。其中EWPH-III-B-E組分DPPH自由基清除率能力最強(qiáng),故將其最為進(jìn)一步研究的對(duì)象。

圖3 Sephadex G-25凝膠層析分離純化EWPH-III-BFig.3 Separation of EWPH-III-B by Sephadex G-25 gel filtration chromatography

餾分DPPH自由基清除率(%)C83.63±1.22dD85.26±0.88cE88.49±0.74aF87.62±0.62b

2.4 MALDI-TOF/TOF-MS質(zhì)譜分析抗氧化肽

采用MALDI-TOF/TOF-MS質(zhì)譜分析抗氧化肽的質(zhì)量指紋圖譜和氨基酸序列,試驗(yàn)結(jié)果如下圖4和圖5所示。

圖4 MALDI-TOF/TOF MS一級(jí)譜圖Fig.4 MALDI-TOF/TOF MS spectrum

圖4中測得值為母離子,從各母離子中選擇豐度值最高的母離子進(jìn)行MS/MS序列分析。圖中709.060的峰為EWPH-III-B-E組分的質(zhì)子化分子([M+H]+),即相對(duì)分子質(zhì)量為709.060。從MALDI-TOF/TOF-MS譜圖上則能清楚看到依舊存在m/z 165.012、332.760、823.745、868.716、1181.032等的雜肽。因此將709.060 Da的離子作為母離子,進(jìn)一步進(jìn)行TOF-MS/MS二級(jí)質(zhì)譜分析,結(jié)果如圖5所示。MS/MS圖譜中低質(zhì)荷比的亞氨離子揭示了肽段的氨基酸組成。在二級(jí)質(zhì)譜圖中有一個(gè)很強(qiáng)的信號(hào)峰即為237.575分子離子峰([M+H]+),通過軟件計(jì)算和分析,得出EWPH-III-B-E組分的氨基酸序列為丙氨酸-甲硫氨酸。

圖5 m/z709.06的MS/MS圖譜Fig.5 MS/MS spectrum of component at m/z 709.06

3 結(jié)論

本研究通過超濾、離子交換色譜、及凝膠過濾色譜分離技術(shù),以肽組分的分子量大小、抗氧化等性質(zhì)的不同對(duì)蛋清蛋白酶解物(EWPH)進(jìn)行逐級(jí)純化。超濾法分離純化EWPH所得的三個(gè)組分中,EWPH-Ⅲ(MW<3 kDa)組分的DPPH自由基清除率最高,達(dá)到79.62%。離子交換層析分離純化EWPH-III所得到2組分中,其中酸性組分A的DPPH自由基清除率為79.86%,堿性組分B的DPPH自由基清除率為82.05%。通過凝膠過濾色譜分離EWPH-III-B所得到4組分中,C組分的DPPH自由基清除率為83.63%,D組分的DPPH自由基清除率為85.26%,E組分的DPPH自由基清除率為88.49%,F組分的DPPH自由基清除率為87.62%,其中EWPH-III-B-E組分抗氧化活性最強(qiáng)。最后通過MALDI-TOF/TOF-MS質(zhì)譜分析抗氧化肽EWPH-III-B-E組分的質(zhì)量指紋圖譜和氨基酸序列得到其氨基酸序列為丙氨酸-甲硫氨酸,目標(biāo)抗氧化肽的功能因子組成為二肽。本研究明確了蛋清蛋白抗氧化肽的抗氧化活性,并對(duì)其含有的抗氧化肽進(jìn)行了分離和結(jié)構(gòu)鑒定,為蛋清蛋白抗氧化肽的開發(fā)和利用提供了理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。