西雙版納12種食用香料植物精油 抑制炎癥因子NO活性研究

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(1.中國科學(xué)院西雙版納熱帶植物園熱帶植物資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,云南勐臘 666303; 2.中國科學(xué)院大學(xué),北京 100049)

食用香料植物又叫作香辛料,大多具有芳香、辛辣等刺激性氣味,具有殺菌、抗氧化、抗炎等藥理作用,用于食物調(diào)味調(diào)香。從香料植物中提取的物質(zhì)不僅能改善食物的風(fēng)味，還可作為天然防腐劑延長(zhǎng)食物的保質(zhì)期[1]。

精油作為香料植物中的主要成分,存在于植物的根、莖、葉、花、果實(shí)、種子等部位,是植物次生代謝產(chǎn)物,易于揮發(fā)并具有愉悅的氣味,西方中世紀(jì)就已廣泛應(yīng)用[2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，精油在抗菌[3-4]、抗氧化[5]、抗炎[6]、抗癌[7]等方面具有重要的作用。Giselle等[8]研究表明,馬鞭草精油對(duì)組胺等引起的小鼠后肢腫脹具有很好的消腫效果;Sharif等[9]研究表明酸棗果實(shí)精油對(duì)TPA(佛波酯)誘導(dǎo)的小鼠皮膚炎癥有較好的治療效果;Lin等[10]研究表明臺(tái)灣肉桂果實(shí)精油對(duì)細(xì)菌脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的炎癥因子NO、TNF-alpha等的產(chǎn)生具有顯著的抑制作用。一氧化氮(NO)作為炎癥反應(yīng)的標(biāo)志產(chǎn)物之一,正常情況下,體內(nèi)的NO含量較低[11]。當(dāng)機(jī)體受到外界(物理、化學(xué)、生物等)刺激時(shí),iNOS被激活,進(jìn)而大量合成NO并參與多種疾病的病理反應(yīng)，如高血壓、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化等[12]。因此,藥理學(xué)上將是否可以抑制NO合成,作為判斷某種物質(zhì)是否具有抗炎活性的重要指標(biāo)。目前,臨床上抗炎藥有兩大類:甾體類和非甾體類。由于抗炎藥的過度使用,耐藥性、毒副作用及新的相關(guān)病癥增加,迫切需要尋找新的低毒、高效的新型抗炎藥[13]。

西雙版納地處我國云南南部,芳香類植物十分豐富,這里是傣族為主的少數(shù)民族聚居地,當(dāng)?shù)馗髅褡鍌鹘y(tǒng)用各種香料植物防治蚊蟲叮咬、清熱解毒、消腫止痛。據(jù)文獻(xiàn)及對(duì)當(dāng)?shù)厮幱弥参镎{(diào)查選取以下12種具有藥食兩用的芳香植物作為研究對(duì)象,其性狀如下:跳蚤草(AdenosmabuchneroidesBonati.):草本,生長(zhǎng)于海拔580～900 m,具特殊香氣[14];錫蘭肉桂(CinnamomumverumPresl.):常綠喬木,枝干灰色具白斑,葉革質(zhì)或近革質(zhì)對(duì)生[15];水香薷(ElsholtziakachinensisPrain.):草本,莖具絨毛,葉卵形或卵狀披針形,基部以上具圓齒,兩面疏被絨毛[16];野拔子(E.rugulosaHemsl.):草本至半灌木,莖多分枝,密被白色絨毛,葉卵形,橢圓址菱狀卵形[17];草八角(Limnophilarugose(Roth)Merr.):多年生宿根草本,葉卵形邊緣具齒,莖葉具八角香氣[14];山蒼子[Litseacubeba(Lour.)Pers.]:灌木或小喬木,葉互生,披針形或長(zhǎng)圓形,具芳香氣味[18];蒜香藤[Mansoaalliacea(Lam.)A.H.Gentry.]:常綠藤狀灌木,具卷須,二出復(fù)葉,深綠橢圓形,有大蒜氣味[19];小蕓木[Micromelumintegerrimum(Buch-Ham.)Roem.]:小喬木,樹皮灰色,葉軸、花序均綠色,密被絨毛,成熟果實(shí)黃色,具香氣[14];毛葉丁香羅勒(OcimumgratissimumLinn. var.suave(Willd.)Hook.f.):丁香羅勒于薄荷羅勒雜交種,多年生灌木,葉、莖具芳香氣味[20];馬來樹胡椒(PiperarborescensRoxb.):小喬木,樹皮灰色,葉軸、花序均綠色,密被絨毛,成熟果實(shí)黃色,具香氣[14];巴西樹胡椒(P.hispidinervumC. DC.):常綠叢生灌木,呈小喬木狀,枝葉、果芳香[14];清香木(PistaciaweinmannifoliaJ. Poisson ex Franch.):灌木或小喬木,小葉葉柄被絨毛,革質(zhì),長(zhǎng)圓形或倒卵狀長(zhǎng)圓形[14]。因此推測(cè)這些芳香植物具有抗炎的效果,對(duì)炎癥相關(guān)因子NO具有較好的抑制作用。此前已有很多文獻(xiàn)報(bào)道這里芳香植物的成分[14],但對(duì)其抗炎功效的研究報(bào)道較少。

本研究選用對(duì)炎癥反應(yīng)較為敏感的RAW264.7細(xì)胞,測(cè)定12種香料植物精油的抗炎活性,并通過GC-MS聯(lián)用技術(shù),對(duì)具有顯著抑制作用的植物精油的化學(xué)成分進(jìn)行測(cè)定,為這些植物精油提供抗炎作用的理論依據(jù)，并為其可能發(fā)揮治療炎癥并發(fā)癥(糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化等)的作用提供一定的指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

食用香料植物 具體信息見表1,均采自中科院西雙版納熱帶植物園;小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞株RAW264.7 中國科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所動(dòng)物種質(zhì)資源庫。青/鏈霉素、DMEM高糖培養(yǎng)基 Hyclone公司;胎牛血清、谷氨酰胺 Gibco公司;磷酸鹽緩沖液、LPS、地塞米松(Dex)、二甲基亞砜(DMSO) Sigma公司;NO檢測(cè)試劑盒、MTS([3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧甲酯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑,內(nèi)鹽]試劑盒 Promega公司。

表1 實(shí)驗(yàn)材料Table 1 Experiment materials

REF5250040多功能酶標(biāo)儀 美國Thermo scientific;Agilent 7890/5975C GC-MS氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Agilent Technologies;98-1-B電熱套 天津市泰思特儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 植物精油的提取 精油提取:采集新鮮所需材料,去除腐爛及發(fā)霉材料,自然陰干,粉碎。稱取一定質(zhì)量的材料加入去離子水,采用水蒸氣蒸餾法,沸騰的同時(shí)在精油接受口用500 mL錐形瓶(其中加入20～30 mL乙醚)提取精油。乙醚及精油被收集在一起,之后通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除乙醚。置于冰箱(4±2) ℃保存[23]。

1.2.2 細(xì)胞活力評(píng)估 用含10%胎牛血清,1000 U/L青、鏈霉素、2 mmol/L谷氨酰胺的DMEM培養(yǎng)基置于37 ℃ 含5% CO2的生物安全柜中培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RAW264.7細(xì)胞制成濃度為1×106個(gè)/mL的細(xì)胞懸液,種于96孔板中。每孔100 μL,每組3個(gè)平行,貼壁培養(yǎng)18 h。吸去原有培養(yǎng)基,PBS洗兩次,空白組更換為新鮮培養(yǎng)基,LPS組加入含濃度為1 μg/mL LPS各100 μL,其他組加入含不同濃度精油(0.001%、0.002%、0.004%、0.005%)的培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24 h。按照每孔20 μL的比例加入MTS,于490 nm處測(cè)定吸光度值[24]。

1.2.3 NO含量測(cè)定 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7細(xì)胞按照1×106個(gè)/mL接種于96孔板中,每孔100 μL。設(shè)置空白對(duì)照組(C組)、Dex組(100 μL/孔培養(yǎng)基中含濃度為1 μg/mL LPS及10 μmol/L Dex)、LPS組(1 μg/mL LPS 100 μL/孔),不同精油+LPS組(不同種濃度精油+LPS濃度為1 μg/mL),每組3個(gè)平行。貼壁18 h后,用不同濃度精油(0.001%、0.002%、0.004%、0.005%)預(yù)處理30 min,Dex預(yù)處理濃度為10 μmol/L。之后除空白組外其余各組均用含1 μg/mL LPS培養(yǎng)基孵育24 h。10000 r/min,5 min后,收集上清,按照Griess試劑盒操作說明,對(duì)上清中NO含量進(jìn)行檢測(cè)[25]。

1.2.4 具有明顯抑制作用精油成分測(cè)定 成分測(cè)定:采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行成分分析,方法如下:吸取一定體積精油加入合適的溶劑(CH2CL2或正己烷)進(jìn)行溶解,置于自動(dòng)進(jìn)樣器,設(shè)置相應(yīng)的參數(shù),運(yùn)行。

氣相條件:色譜柱:Agilent 19091J-115,HP-5(5% Phenyl Methyl Siloxan,50 m×0.32 mm×0.52 um);進(jìn)樣口溫度:250 ℃;柱箱升溫程序:50 ℃起始,以5 ℃/min的速率從100 ℃,保持5 min,然后以25 ℃/min的速率從100 ℃升到250 ℃保持5 min;進(jìn)樣量:1 μL分流比50∶1;進(jìn)樣口壓力:90 kPa;流速:1.8 mL/min。

質(zhì)譜條件:電離方式EI,電子轟擊能量70 eV,掃描范圍m/z 50～550;離子源溫度230 ℃;四級(jí)桿溫度150 ℃。

化學(xué)成分鑒定:采用NIST14數(shù)據(jù)庫對(duì)質(zhì)譜圖進(jìn)行自動(dòng)檢測(cè),參考相關(guān)文獻(xiàn)中質(zhì)譜資料(線性保留指數(shù)由一系列直鏈烷烴在HP-5(C8～C30)毛細(xì)管色譜柱的保留時(shí)間計(jì)算決定)[25],最終對(duì)精油的化學(xué)成分進(jìn)行定性分析(RI計(jì)算公式為IX=RI1+[RI2-RI1]/[RT2-RT1]×[RT2-RTX],其中IX為計(jì)算化合物的保留指數(shù),RI1,RTX,RT2分別為前面化合物,待計(jì)算化合物及后面化合物的保留時(shí)間,RI1,RI2分別為前面化合物和后面化合物的保留指數(shù))。色譜峰面積運(yùn)用歸一化定量,計(jì)算得出各組分百分含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Graph Prism 5.0進(jìn)行分析,組間比較用單因素方差分析(One-Way ANOVA),組間兩兩比較采用Dunnett’s t-test檢驗(yàn),計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示,p<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 12種植物精油對(duì)RAW264.7細(xì)胞活性的影響

圖1～3均與C組比較,圖4～6均與LPS組比較。*表示差異顯著(p<0.05)**表示差異極顯著(p<0.01)***表示差異高度顯著(p<0.001),圖2～圖6同。圖1～圖3表示精油濃度在一定范圍內(nèi),各種來源的植物精油對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響。馬來樹胡椒精油在濃度為0.005%對(duì)細(xì)胞有顯著抑制作用(p<0.05),細(xì)胞活力降至81.62%，蒜香藤精油在濃度為0.004%及0.005%是對(duì)細(xì)胞有高度顯著抑制作用(p<0.001),細(xì)胞活力降至64.18%、54.32%,因此，未進(jìn)行后續(xù)NO含量的測(cè)定。精油作為一種混合物,可能是其中的多種成分共同起作用,表現(xiàn)出對(duì)RAW264.7細(xì)胞一定的抑制作用;巴西樹胡椒精油、跳蚤草精油、小蕓木精油、山蒼子葉精油濃度在0.001%～0.005%范圍內(nèi)對(duì)細(xì)胞活力有一定的促進(jìn)作用，但差異不顯著(p>0.05),水香薷精油、錫蘭肉桂精油、野拔子精油、清香木精油、草八角精油、毛葉丁香羅勒精油濃度在0.001%～0.005%范圍內(nèi)對(duì)細(xì)胞活力無顯著影響(p>0.05)。與Li等[25]、董麗華等[26]報(bào)道的麻欠、花椒精油對(duì)細(xì)胞活力的影響結(jié)果類似。

圖1 植物精油對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響Fig.1 Effects of plants essential oil on cell viability in RAW264.7 cells

圖3 植物精油對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響Fig.3 Effects of plants essential oil on cell viability in RAW264.7 cells

2.2 各種精油對(duì)LPS誘導(dǎo)的NO產(chǎn)生的影響

圖4～圖6,表明在0.001%～0.005%濃度范圍內(nèi),在LPS刺激24 h后,空白組細(xì)胞NO產(chǎn)生量分別為:(2.33±0.13)、(0.89±0.08)、(1.31±0.03) μmol/L,LPS組NO生成量顯著升高為:(40.69±0.79)、(46.44±1.78)、(40.53±0.96) μmol/L,與楊晶晶[25]等的造模結(jié)果類似,表明造模成功;而馬來樹胡椒精油、錫蘭肉桂精油、水香薷精油在濃度為0.001%～0.005%濃度范圍內(nèi)對(duì)NO產(chǎn)生具有高度顯著抑制作用(p<0.0001),清香木精油在0.002%～0.005%濃度范圍內(nèi)對(duì)NO產(chǎn)生具有高度顯著抑制作用(p<0.0001)、毛葉丁香羅勒精油(0.005%)、蒜香藤精油(0.002%)對(duì)NO的產(chǎn)生具有高度顯著的抑制作用(p<0.0001),并呈濃度依賴型,上述精油中，除毛葉丁香羅勒及蒜香藤外,其他精油在(0.001%～0.005%)濃度范圍內(nèi)抑制效果均優(yōu)于陽性對(duì)照地塞米松(Dex)。抑制強(qiáng)度順序?yàn)轳R來樹胡椒>水香薷>錫蘭肉桂>清香木>蒜香藤>毛葉丁香羅勒。

圖4 植物精油對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生NO的影響Fig.4 Effects of plants essential oil on NO production in RAW264.7 cells induced by LPS

圖5 植物精油對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生NO的影響Fig.5 Effects of plants essential oil on NO production in RAW264.7 cells induced by LPS

圖6 植物精油對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生NO的影響Fig.6 Effects of plants essential oil on NO production in RAW264.7 cells induced by LPS

2.3 具有顯著抑制作用精油的成分分析

對(duì)具有顯著抑制效果的馬來樹胡椒、錫蘭肉桂、清香木、毛葉丁香羅勒、蒜香藤和水香薷的精油成分進(jìn)行了分析,結(jié)果見表2～表7。

表7 水香薷精油主要化學(xué)成分(含量大于1%)Table 7 Chemical compositions of E. kachinensis Essential oil

表2 馬來樹胡椒精油主要化學(xué)成分(含量大于1%)Table 2 Chemical compositions of P. arborescens essential oil

圖7 馬來樹胡椒精油氣相色譜圖Fig.7 The GC-MSFigure of P. arborescens essential oil

馬來樹胡椒精油化學(xué)成分共鑒定出74種化合物。含量在1%以上的有9種,如表2所示,含量最高的為洋元荽醚(57.28%),其他含量較高的依次為百里酚:7.43%,雙環(huán)[7.2.0]碳-4-烯:3.09%,p-傘花烯:2.87%。

圖8 錫蘭肉桂精油氣相色譜圖Fig.8 The GC-MSFigure of C. verum essential oil

錫蘭肉桂精油化學(xué)成分共鑒定出26種化合物。含量在1%以上的有6種,如表3所示,含量最高的為5-烯丙基愈創(chuàng)木烯為84.03%,其他依次為反式肉桂醛4.63%,1-石竹烯3.45%。

表3 錫蘭肉桂精油主要化學(xué)成分(含量大于1%)Table 3 Chemical compositions of C. verum essential oil

圖9 清香木精油氣相色譜圖Fig.9 The GC-MSFigure of P. weinmannifolia essential oil

清香木精油化學(xué)成分共鑒定出化合物58種。含量在1%以上的有14種,如表4所示,含量最高的為α-蒎烯:43.39%,其次依次為D-檸檬烯:9.12%,β-蒎烯:7.76%,莰烯:6.61%等。

表4 清香木精油主要化學(xué)成分(含量大于1%)Table 4 Chemical compositions of P. weinmannifolia essential oil

圖10 毛葉丁香羅勒氣相色譜圖Fig.10 The GC-MSFigure of O. gratissimum essential oil

毛葉丁香羅勒精油化學(xué)成分共鑒定出化合物40種。含量在1%以上的有6種,如表5所示,含量最高的為丁香酚苯乙醚:67.29%,其他依次為1,3,6-羅勒烯:13.62%,4-異丙基-3-甲基苯酚:3.69%等。

表5 毛葉丁香羅勒精油主要化學(xué)成分(含量大于1%)Table 5 Chemical compositions of O. gratissimum essential oil

圖11 蒜香藤精油氣相色譜圖Fig.11 The GC-MSFigure of M. alliacea essential oil

蒜香藤精油化學(xué)成分共鑒定出22種化合物。含量在1%以上的有6種，如表6所示,含量最高的為二烯丙基二硫醚:56.54%,其他依次為二烯丙基三硫醚:24.06%,二烯丙基硫醚:4.77%,1-辛烯-3-醇:4.74%,二烯丙基四硫醚:4.09%等。

表6 蒜香藤精油主要化學(xué)成分(含量大于1%)Table6 Chemical compositions of M. alliacea essential oil

圖12 水香薷精油氣相色譜圖Fig.12 The GC-MSFigure of E. kachinensis Essential oil

水香薷精油化學(xué)成分共鑒定出31種化合物。含量在1%以上的有6種，如表7所示,含量最高的為D(+)-Carvone(右旋香芹酮):46.53%,其他依次為1-(3-甲基-2-呋喃基)-3-甲基-2-丁烯-1-酮:33.13%,1-Octen-3-ylacetate(1-辛烯-3-醇乙酸酯):4.64%等。

通過GC-MS對(duì)其成分進(jìn)行分析可知,抗炎活性成分可能與精油中的D-檸檬烯、α-蒎烯[27-31]、肉桂醛[32]等物質(zhì)相關(guān)。蒜香藤中二烯丙基二硫醚、二烯丙基三硫醚等和大蒜中的成分類似,這些可能是蒜香藤中的抗炎活性物質(zhì)[33]。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)選取西雙版納地區(qū)12種食用香料植物精油作為研究對(duì)象,首次報(bào)道跳蚤草、水香薷、野拔子、草八角、蒜香藤、小蕓木、毛葉丁香羅勒、馬來樹胡椒、巴西樹胡椒等精油的抗炎活性。其中馬來樹胡椒精油、錫蘭肉桂精油、清香木精油、毛葉丁香羅勒精油、蒜香藤精油和水香薷精油對(duì)炎癥因子NO的產(chǎn)生具有顯著的抑制效果。其抑制NO活性大小依次為馬來樹胡椒>水香薷>錫蘭肉桂>清香木>蒜香藤>毛葉丁香羅勒。上述精油中,低濃度的馬來樹胡椒精油表現(xiàn)出更好的抗炎效果且對(duì)細(xì)胞活力無顯著影響。通過GC-MS對(duì)馬來樹胡椒精油、巴西樹胡椒精油、毛葉丁香羅勒精油等成分進(jìn)行分析,精油成分以烯烴類為主,其主要成分多樣,抗炎作用可能是多成分共同作用。本研究為傣族人民對(duì)這些植物的傳統(tǒng)藥用及食用提供了科學(xué)的依據(jù)。此外,馬來樹胡椒精油、錫蘭肉桂精油、清香木精油、毛葉丁香羅勒精油等作為一種天然抗炎材料在藥用及功能食品產(chǎn)業(yè)等方面具有較大的潛力。這些植物精油抗炎活性機(jī)制有待進(jìn)一步研究。