帕金森病患者外周血中免疫相關(guān)細胞的分析

徐澤恒,喬 蕊,蔣 森,孟新玲,楊新玲*

(1新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,烏魯木齊 830063;2新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)院腦病一科;*通訊作者,E-mail:poplar862@sohu.com)

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一種常見的中老年人神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變,我國65歲以上人群中的患病率為1.7%[1],其特征性的臨床主征是靜止性震顫、肌張力增高、運動遲緩及姿勢平衡障礙,明顯影響老年人群的生活質(zhì)量。其病因?qū)W研究顯示帕金森病發(fā)病與年齡、遺傳、氧化應(yīng)激、環(huán)境等因素有關(guān),近年來,研究者又從動物實驗中發(fā)現(xiàn),中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫反應(yīng)與神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變之間有相關(guān)性。既往研究顯示,血腦屏障的存在,機械性地阻止多種物質(zhì)由血液進入腦組織[2],因此外周免疫在機體非感染狀態(tài)下較少影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)。但目前已有相關(guān)動物實驗提示,帕金森病模型小鼠的黑質(zhì)處有T淋巴細胞浸潤[3],提示帕金森病的發(fā)病及病程進展可能與免疫反應(yīng)有關(guān)。因此,外周血中的體液免疫反應(yīng)及細胞免疫反應(yīng)是不是加速中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元變性退化引起了研究者的重視,本研究通過比較帕金森病患者外周血中免疫相關(guān)細胞與健康對照組的差異性及探討是否與疾病嚴重程度有關(guān),以期為帕金森病的診治及延緩病情進展提供新的診療方法。

1 對象和方法

1.1 研究對象

1.1.1 病例組 選擇2017-12～2018-08就診于新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,并經(jīng)副主任及以上醫(yī)師明確診斷為PD的患者,共105例,其中男性57例,女性48例。漢族58例,維吾爾族32例,哈薩克族15例,其年齡在50-72歲,平均(59.90± 5.36)歲,病程2-15年。符合英國腦庫帕金森病診斷標(biāo)準[4]。入選病例組按照統(tǒng)一帕金森氏病評分量表第三部分(UPDRS Ⅲ)進行評分。

1.1.2 對照組 共103名,其中男性53名,女性50名。漢族55名,維吾爾族31名,哈薩克族17名,年齡在51-72歲,平均(59.91± 5.00)歲,為同期健康體檢者,無明顯疾病史。

入選和排除標(biāo)準:病例組為有典型帕金森病病史,對照組為同期健康體檢者。病例組及對照組均排除自身免疫性疾病、正在使用對免疫系統(tǒng)有影響的藥物及患有影響免疫系統(tǒng)的疾病,并排除腫瘤性疾病、血液病,且外周血未見炎性指標(biāo)異常。

1.2 研究方法

采用微量全血直接免疫熒光染色法,檢測外周血中T細胞、B細胞及NK細胞亞群的百分比。每位受試者均采集清晨空腹靜脈血于抗凝管中,實驗時每份血樣中取等量微量全血,每份微量全血針對所測淋巴細胞亞群的不同而加入對應(yīng)的細胞表面特異性分子的熒光抗體進行標(biāo)記。所用熒光標(biāo)記的抗體為:APC標(biāo)記的抗人CD4抗體,PE標(biāo)記的抗人CD3抗體,FITC標(biāo)記的抗人CD8抗體,PE標(biāo)記的抗人CD25抗體,FITC標(biāo)記的抗人CD56抗體,FITC標(biāo)記的抗人CD19抗體。以上抗體購自美國BD公司。每份微量全血經(jīng)充分標(biāo)記后,經(jīng)過紅細胞裂解及離心分離后,再對其進行重懸,上流式細胞儀檢測淋巴細胞亞群百分比?？紤]標(biāo)本保存時間及溫度對淋巴細胞數(shù)量的影響,每份新鮮血標(biāo)本從收集至上流式細胞儀不超過3 d時間[5]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS23.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析,計數(shù)資料采用構(gòu)成比表示,組間差異性分析采用卡方檢驗,計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準差表示,如資料符合正態(tài)分布,兩組間差異性分析采用兩獨立樣本t檢驗,三組及以上采用方差分析,如不符合正態(tài)分布,采用秩和檢驗來進行分析。采用Pearson相關(guān)分析各個指標(biāo)間的相關(guān)性,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料比較

病例組及對照組在性別、年齡、民族分布上差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),具有可比性(見表1)。

2.2 病例組及對照組T、B淋巴細胞亞群及NK細胞百分比結(jié)果分析

2.2.1 病例組與對照組比較 病例組CD3+、CD4+、CD25+T淋巴細胞亞群較對照組百分比值降低(P<0.01),CD8+T淋巴細胞亞群、CD19+B淋巴細胞亞群及CD56+NK細胞與對照組相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(見表2)。

表1病例組及對照組基本信息比較

Table1Comparisonofbasicinformationbetweencasegroupandcontrolgroup

分組n性別(例)民族(例)年齡(歲)男女χ2P漢族維吾爾族哈薩克族χ2Px±stP病例組10557480.1670.6835832150.2010.90459.90±5.360.0110.991對照組103535055311759.91±5.00

表2T淋巴細胞亞群在病例組及對照組結(jié)果比較(%)

Table2ComparisonofTlymphocytesubsetsbetweencasegroupandcontrolgroup(%)

分組nCD8TCD4TCD3TCD25TCD19CD56病例組10532.95±8.5833.43±6.6056.81±6.861.30±0.2810.46±3.816.82±3.07對照組10334.34±7.1944.59±6.7064.57±6.682.45±0.3810.91±3.767.38±3.09t1.26612.1078.26224.9310.8471.31P0.207<0.001<0.001<0.0010.3980.192

2.2.2 相關(guān)性分析 進一步對病例組的CD3+、CD4+、CD25+T淋巴細胞亞群百分比與UPDRS評分第Ⅲ部分分值進行相關(guān)性分析,經(jīng)Pearson相關(guān)性分析顯示,UPDRS評分結(jié)果與CD4+T、CD3+T、CD25+T細胞指標(biāo)間均具有相關(guān)性,且為負相關(guān),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(見表3)。

3 討論

PD是位居第二位的神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變,臨床上以椎體外系為癥狀,主要表現(xiàn)少動、僵直及震顫等癥狀,病情進行性加重,嚴重影響患者的身心健康及生活質(zhì)量,病程晚期多因嚴重的運動障礙導(dǎo)致臥床,并引發(fā)墜積性肺炎、褥瘡等并發(fā)癥,預(yù)后差。PD病理表現(xiàn)為中腦黑質(zhì)處多巴胺能神經(jīng)元的變性、凋亡,導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)遞質(zhì)減少,引起紋狀體內(nèi)乙酰膽堿-多巴胺兩種遞質(zhì)失去平衡而發(fā)病,往往患者就診時,黑質(zhì)處的多巴胺能神經(jīng)元損失大于50%以上,引起紋狀體處多巴胺能神經(jīng)遞質(zhì)明顯較少。目前研究結(jié)果提示引起多巴胺能神經(jīng)元凋亡的原因與年齡、基因易感性、環(huán)境因素等有關(guān)[6]。多巴胺能神經(jīng)元減少的具體機制可能與氧化應(yīng)激、興奮性毒性所致的胞內(nèi)鈣超載、線粒體功能障礙、蛋白水解應(yīng)激等有關(guān)。PD患者腦部尸檢提示黑質(zhì)內(nèi)殘存多巴胺能神經(jīng)元胞體內(nèi)有路易小體形成,其主要成分為α-Synuclein。腦中其他部位的多巴胺能神經(jīng)元亦有損害,但其程度較黑質(zhì)-紋狀體系統(tǒng)輕?；赑D患者胞內(nèi)異常蛋白質(zhì)的產(chǎn)生,及針對性的多巴胺能神經(jīng)元損傷,提示嗜酸性包涵體內(nèi)的異常蛋白質(zhì)可能作為一種自身抗原,引發(fā)了免疫反應(yīng),引起多巴胺能神經(jīng)元的損傷及減少。故近年來從免疫角度研究其發(fā)病起因及病情進展的動物實驗及臨床研究逐漸增多。以期能盡早干預(yù)腦內(nèi)發(fā)生的慢性炎癥反應(yīng),減緩神經(jīng)元的損傷,延緩病情的進展。

表3病例組淋巴細胞亞群百分比與UPDRS評分第Ⅲ部分相關(guān)性分析結(jié)果

Table3CorrelationbetweenthepercentageoflymphocytesubsetsandpartⅢofUPDRSscoreincasegroup

指標(biāo)rPCD3T-0.82<0.001CD4T-0.614<0.001CD25T-0.571<0.001

隨著基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)的發(fā)展,在分子細胞水平上對PD的病理生理反應(yīng)有了突破性的發(fā)現(xiàn),對黑質(zhì)處細胞成分的觀察分析發(fā)現(xiàn)其小膠質(zhì)細胞較腦內(nèi)其他部位更為密集[7],而小膠質(zhì)細胞承擔(dān)起中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫反應(yīng)。激活的小膠質(zhì)細胞釋放神經(jīng)毒性因子,導(dǎo)致其周圍多巴胺能神經(jīng)元的損傷及死亡[8]。國內(nèi)徐評議教授課題組對一例PD患者進行尸檢,發(fā)現(xiàn)其黑質(zhì)部有CD4+、CD8+T淋巴細胞浸潤及表達HLA-DR陽性的小膠質(zhì)細胞。同時也有實驗提示PD模型鼠黑質(zhì)處有CD+T淋巴細胞聚集[9],且異常聚集的α-Synuclein可以激活小膠質(zhì)細胞引起炎癥反應(yīng)[10],提示腦內(nèi)的免疫紊亂可能與原位的小膠質(zhì)細胞激活及周圍淋巴細胞的募集兩者均有關(guān)。而已有的研究在分子水平及解剖結(jié)構(gòu)上均有證據(jù)可支持免疫反應(yīng)參與其病情進展[11-13]。從分子水平上,有研究提示在PD患者的胃腸道及頸深部淋巴結(jié)檢測到α-Synuclein[11,12]。不同于以往認為的血腦屏障可高度阻斷外周免疫與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用,已有研究顯示血腦屏障的基底膜增厚和空泡形成[13],且有解剖學(xué)上發(fā)現(xiàn)腦膜內(nèi)有淋巴導(dǎo)管樣結(jié)構(gòu),可以引流腦脊液至頸深淋巴導(dǎo)管,故中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫豁免地位受到質(zhì)疑,也引發(fā)了科研工作者的猜想,即腦內(nèi)的異常蛋白可以引起抗原呈遞細胞及淋巴細胞發(fā)生免疫反應(yīng),中樞的異常蛋白質(zhì)可能作為一種抗原,刺激外周免疫系統(tǒng),引起免疫反應(yīng)作用于原發(fā)病變部位[14]。因此,本實驗基于對上述免疫角度的研究方向,對PD患者外周血中免疫相關(guān)細胞進行分析,以期發(fā)現(xiàn)在PD病程中是否有一定的變化規(guī)律,從而為其診療帶來新的方法。

在機體的免疫系統(tǒng)中,細胞免疫主要依靠T淋巴細胞介導(dǎo),根據(jù)T淋巴細胞表面特異性表達分子的不同,將其分為:CD8+T淋巴細胞亞群,參與直接細胞殺傷作用;CD4+T淋巴細胞亞群,介導(dǎo)免疫提呈反應(yīng),聯(lián)合B淋巴細胞輔助體液免疫反應(yīng)。近年來在CD4+T淋巴細胞亞群中發(fā)現(xiàn)了CD4+CD25+Foxp3+T淋巴細胞亞群,及調(diào)節(jié)性T淋巴細胞亞群(regulatory T cells,Treg),該T淋巴細胞亞群可以分泌TGF-β及IL-10等細胞因子,參與免疫抑制,有研究表明其可以通過抑制小膠質(zhì)細胞對異常蛋白即硝基化的α-syn的免疫反應(yīng)而起到保護神經(jīng)元的作用[15]。本研究提示PD患者外周血中CD3+T淋巴細胞、CD4+T淋巴細胞及CD25+T淋巴細胞外周血百分比水平低于健康對照組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。且與UPDRS Ⅲ評分成負相關(guān),與既往趙旭[16]及馮雪儀等[17]臨床研究結(jié)果相一致。也有研究提示CD3+T淋巴細胞水平顯著高于健康對照組[18]。結(jié)合病理學(xué)提示黑質(zhì)處存在HLA-DR陽性小膠質(zhì)細胞,考慮PD患者黑質(zhì)處引起多巴胺能神經(jīng)元損傷的免疫反應(yīng)性質(zhì)以細胞免疫反應(yīng)為主。進一步考慮黑質(zhì)處的異常免疫反應(yīng)可能與T淋巴細胞浸潤、歸巢等反應(yīng)有關(guān)。

體液免疫反應(yīng)主要為B淋巴細胞通過抗原刺激,產(chǎn)生針對性的抗體,起到適應(yīng)性免疫反應(yīng)作用。且PD患者基底節(jié)處的α-Synuclein作為一種異常蛋白質(zhì),是否可以觸發(fā)B淋巴細胞及抗原提呈細胞引起體液免疫反應(yīng)。而既往有病例對照研究提示PD患者血清中IgG水平較高,且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義[19]。國內(nèi)也有實驗提示PD患者血清IgG可以依賴補體系統(tǒng)殺傷多巴胺能神經(jīng)元[20]。而筆者的資料顯示,PD組B淋巴細胞水平較健康對照組無明顯差異,可以認為PD患者體液免疫反應(yīng)未見明顯異常,考慮與B淋巴細胞較T淋巴細胞浸潤及穿過血腦屏障程度受限更明顯有關(guān)。

而NK細胞為機體固有免疫的主要組成部分,其細胞表面特異性表達CD56抗原,該類細胞可以分泌大量的細胞因子調(diào)控免疫反應(yīng)及殺傷病原體,有相關(guān)動物實驗提示在選擇性阻止NK細胞向中樞神經(jīng)系統(tǒng)歸巢反應(yīng)的小鼠模型中,可以引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)及自身免疫反應(yīng)[21],進一步考慮NK細胞是否可以影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的慢性炎癥反應(yīng)。有基于上述觀點的病例對照研究提示PD患者外周血中NK細胞較對照組水平上升,結(jié)論具有統(tǒng)計學(xué)意義[22],而本實驗未見NK細胞在兩組中有明顯差異性。筆者考慮與其向PD中樞神經(jīng)系統(tǒng)的歸巢較T淋巴細胞弱有關(guān)。

PD患者黑質(zhì)處聚集的HLA-DR陽性小膠質(zhì)細胞、T淋巴細胞及浸潤的炎癥因子,提示其病理生理反應(yīng)過程很可能與細胞免疫有關(guān),進一步說明了黑質(zhì)處多巴胺能神經(jīng)元的減少與免疫反應(yīng)有關(guān),且該種免疫反應(yīng)可能涉及外周免疫細胞的參與。但其使動因素仍未有相對明確的定論,是外周的免疫紊亂激活了膠質(zhì)細胞,亦或是中樞異常蛋白質(zhì)的形成,刺激了外周免疫系統(tǒng),仍需進一步研究以明確。由于實驗時間的限制,本實驗未進行更進一步的追蹤隨訪,如追蹤同一患者病程中動態(tài)隨訪其淋巴細胞及炎癥因子水平波動情況及免疫細胞成分及比例的變化情況,且進行同一患者同時期外周血及腦脊液中炎癥因子水平的變化情況,可進一步明確PD患者免疫紊亂發(fā)生的詳細情況,以期為診療帶來新的發(fā)現(xiàn)。