miR-224在宮頸癌組織中的表達(dá)及對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的調(diào)控作用

童 揚(yáng),姜 靜*,陳小華,趙 雪,夏 雪,孫莉婭

(1四川省宜賓市第二人民醫(yī)院南區(qū)婦科,宜賓 644000;2四川省宜賓市第二人民醫(yī)院研究中心;3四川省宜賓市第二人民醫(yī)病理科;4四川省宜賓市第二人民醫(yī)院婦;*通訊作者,E-mail:914016419@qq.com)

微小RNA(miRNA,miR)是一類(lèi)非編碼的長(zhǎng)約22 nt小分子RNA,通過(guò)與靶基因mRNA的3′非翻譯區(qū)(3′-UTR)結(jié)合,調(diào)控靶基因表達(dá),發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用,調(diào)節(jié)如細(xì)胞分化、增殖、凋亡和腫瘤形成等多種細(xì)胞功能。某些miR的異常表達(dá)可直接作為抑癌或促癌因素,參與人類(lèi)腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[1]。有研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌患者存在多種miR(miR-119b、miR-218、miR-119a)的表達(dá)異常現(xiàn)象,且通過(guò)調(diào)控宮頸癌的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)或增殖遷移能力可產(chǎn)生抑癌或促癌作用[2-4]。miR-224是miR家族的一員,被證實(shí)與胃癌、乳腺癌、卵巢癌的EMT及增殖、遷移密切相關(guān),有研究報(bào)道m(xù)iR-224與宮頸癌的病理特征及預(yù)后密切相關(guān)[5,6],但其在宮頸癌中的具體作用及機(jī)制仍缺乏相關(guān)報(bào)道。本研究檢測(cè)了宮頸癌組織和宮頸癌細(xì)胞中miR-224表達(dá)的改變,并干擾其表達(dá)水平,以探索其對(duì)宮頸癌細(xì)胞EMT及增殖、遷移能力的影響。

1 資料與與方法

1.1 一般資料

選取于2018年1月至6月在宜賓市第二人民醫(yī)院救治的宮頸癌患者24例作為研究對(duì)象,年齡36-58歲,平均年齡(45.8± 5.6)歲。納入標(biāo)準(zhǔn):①組織活檢確診為宮頸癌;②無(wú)其他部位惡性腫瘤;③患者及家屬均知情并同意參與該研究。排除標(biāo)準(zhǔn):①妊娠期及哺乳期患者;②既往有慢性腎病、慢性肝病患者;③合并自身免疫系統(tǒng)疾病的患者。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞株及主要試劑 人宮頸癌細(xì)胞株HCE1由宜賓市第二人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心提供。兔多克隆抗體E-cadherin、N-cadherin和vimentin均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司,Cell Counting Kit-8(CCK-8)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自中國(guó)碧云天公司,DMEM/F12培養(yǎng)基、胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司,胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司,Trizol Reagent購(gòu)自Invitrogen公司,miR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Thermo公司,PCR mix購(gòu)自日本Toyobo公司。

1.2.2 宮頸癌細(xì)胞的增殖培養(yǎng) 人宮頸癌細(xì)胞株HCE1常規(guī)培養(yǎng)于5%的CO2飽和溫度、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)基為含10%胎牛血清(FBS)和1%青霉素、鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基,每2-3 d用0.25%胰酶消化,以1 ∶2傳代。在HCE1細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定、呈對(duì)數(shù)期時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 miR-224分組與瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 miR-224的提取和反轉(zhuǎn)錄參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,miR-224抑制劑采用miR-224成熟體的反向互補(bǔ)序列,并對(duì)所有堿基進(jìn)行2′甲基修飾購(gòu)自中國(guó)百奧邁科生物技術(shù)有限公司,轉(zhuǎn)染步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)執(zhí)行。人宮頸癌細(xì)胞株HCE1接種于6孔板,加入含10% FBS的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng),在37 ℃ 5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),約50%-60%融合時(shí),采用脂質(zhì)體Lipofectamine 3000方法瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。共分四組:空白組,常規(guī)培養(yǎng)的宮頸癌細(xì)胞;陰性對(duì)照(negative control,NC)組,轉(zhuǎn)染miR-224 NC(100 nmol/ml)的宮頸癌細(xì)胞;miR-224抑制劑組,轉(zhuǎn)染miR-224抑制劑(100 nmol/ml)的宮頸癌細(xì)胞;miR-224模擬劑組,轉(zhuǎn)染miR-224模擬劑(100 nmol/ml)的宮頸癌細(xì)胞。嚴(yán)格按照脂質(zhì)體法進(jìn)行轉(zhuǎn)染,6 h內(nèi)用OMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.4 E-cadherin、N-cadherin和vimentin水平檢測(cè) 獲得患者癌組織及癌旁組織,以及相應(yīng)細(xì)胞系樣本,均嚴(yán)格按照RNAgent Isolation System說(shuō)明書(shū),抽提總RNA。取1 μg總RNA,嚴(yán)格按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。PCR反應(yīng)在PE公司的GeneAmp8 5700型PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行,嚴(yán)格按照SYBR green說(shuō)明書(shū)加樣,總反應(yīng)體系20 μl,各樣本加cDNA 2 μl;SYBR green 10 μl;商品化引物2 μl(miR-224,上海生工,中國(guó);GAPDH:MQP027158;Genecopoeia公司,美國(guó));RANase Rree去離子水2 μl。按兩步法反應(yīng)94 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,40個(gè)循環(huán),以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參照進(jìn)行分析,檢測(cè)E-cadherin、N-cadherin和vimentin基因的表達(dá)水平。采用Western blot進(jìn)行檢測(cè)。按不同因素處理細(xì)胞,提取蛋白,測(cè)定蛋白濃度,采用5×上樣緩沖液稀釋,使用12%分離膠電泳,轉(zhuǎn)膜90 min,5%脫脂奶粉室溫封閉1 h,TBST漂洗10 min×3次,用5%TBST稀釋的BSA稀釋一抗,分別與膜接觸4 ℃孵育過(guò)夜后，用TBST漂洗10 min×3次,加二抗室溫下孵育1 h后,用TBST洗膜10 min×3次,在Gene Gnome曝光儀上曝光并拍照。

1.2.5 宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力的檢測(cè) ①采用細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)宮頸癌細(xì)胞增殖能力,具體操作方法如下:在96孔板中每孔接種5×103個(gè)細(xì)胞,每組設(shè)置4個(gè)復(fù)孔。將細(xì)胞剛好貼壁記為0 h,于12 h利用CCK-8檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖;每孔加入10 μl CCK-8溶液,空白對(duì)照孔加10 μl 0.9%生理鹽水,在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1 h,然后用酶標(biāo)儀在570 nm處測(cè)定各孔的吸光度(A)值。②采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)宮頸癌細(xì)胞的遷移能力,具體操作如下:細(xì)胞按每孔約5×105個(gè)細(xì)胞的密度接種到6孔板,培養(yǎng)24 h至細(xì)胞伸展,用無(wú)菌200 μl的槍頭在細(xì)胞層垂直、快速劃痕。劃痕結(jié)束后在細(xì)胞孵化箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h后觀察劃痕愈合。③采用侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)宮頸癌細(xì)胞侵襲能力,具體操作方法如下:Transwell小室(Millipore,USA)底部鋪入50 μl Basement Membrane Matrix(Corning,USA,稀釋=1 ∶2),置于細(xì)胞孵箱中2 h。收獲細(xì)胞,制成每200 μl DMEM(GIBECO,USA)中含6×104個(gè)細(xì)胞懸液。Transwell上室加入200 μl DMEM細(xì)胞懸液,下室加入800 μl含10%胎牛血清DMEM,置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中。侵襲48 h后取出小室,多聚甲醛中固定10 min,結(jié)晶紫中染色3 min。PBS洗凈結(jié)晶紫,并用棉簽輕輕擦拭Transwell小室上室底部。晾干后,將小室倒置于顯微鏡下觀察并拍照,計(jì)算細(xì)胞數(shù)目觀察各組細(xì)胞的侵襲能力。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 miR-224在宮頸癌及癌旁正常組織的表達(dá)

收集24例宮頸癌組織和24例癌旁組織,采用RT-PCR法檢測(cè)腫瘤組織以及癌旁組織中miR-224的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,腫瘤組織miR-224的表達(dá)顯著高于癌旁組織,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(7.56±1.48vs4.28±0.65,t=3.176,P=0.002,見(jiàn)圖1)。

圖1 miR-224在24例宮頸癌組織和24例癌旁正常組織中的表達(dá)Figure 1 Expression of miR-224 in 24 cases of cervical cancer tissues and 24 cases of adjacent normal tissues

2.2 miR-224對(duì)HCE1細(xì)胞增殖能力的影響

采用miR-224抑制劑及模擬劑轉(zhuǎn)染宮頸癌細(xì)胞株HCE1,采用CCK8法檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力。結(jié)果顯示,不同組別之間細(xì)胞增殖能力有顯著差異(F=13.33,P=0.002)。進(jìn)一步行兩兩比較顯示,miR-224抑制劑作用后,細(xì)胞增殖能力較NC組顯著下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.659,P=0.022);而采用miR-224模擬劑作用后,細(xì)胞的增殖能力較NC組顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.454,P=0.003,見(jiàn)圖2A)。

2.3 miR-224對(duì)HCE1細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響

為進(jìn)一步探究miR-224對(duì)宮頸癌細(xì)胞株HCE1遷移、侵襲能力的影響,采用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力、侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)侵襲能力。miR-224抑制劑組、miR-224模擬劑組及NC組之間遷移能力(F=8.805,P=0.007)、侵襲能力(F=10.73,P=0.004)組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)一步行兩兩比較顯示,miR-224抑制劑作用后,細(xì)胞愈合面積比例顯著低于NC組(t=4.117,P=0.015),而miR-224模擬劑組細(xì)胞愈合面積比例顯著高于NC組(t=8.672,P=0.001,見(jiàn)圖2B)。由此可見(jiàn),抑制miR-224可以抑制宮頸癌細(xì)胞的遷移能力。miR-224抑制劑作用后,miR-224抑制劑組細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)明顯少于NC組(t=8.041,P=0.001),而miR-224模擬劑組,細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)明顯多于NC組(t=3.448,P=0.026,見(jiàn)圖2C)。結(jié)果提示,抑制miR-224可以抑制宮頸癌細(xì)胞的侵襲。

與NC組相比較,*P<0.05,**P<0.01圖2 四組宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力比較Figure 2 Comparison of proliferation, migration and invasion ability of HCE1 cells among four groups

2.4 EMT標(biāo)志物的表達(dá)水平

為進(jìn)一步探究miR-224促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞株HCE1增殖、遷移和侵襲的機(jī)制,采用Western blot法檢測(cè)不同組別EMT標(biāo)志物E-cadherin、N-cadherin和vimentin的表達(dá)。三組間EMT標(biāo)志物E-cadherin(F=12.66,P=0.002)、N-cadherin(F=16.79,P=0.001)和vimentin(F=13.88,P=0.002)的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)一步行兩兩比較顯示,miR-224抑制劑組上皮標(biāo)記物E-cadherin的蛋白表達(dá)顯著高于NC組(t=6.148,P=0.004);而間質(zhì)標(biāo)記物N-cadherin(t=7.021,P=0.002)和vimentin(t=4.569,P=0.010)的蛋白表達(dá)顯著低于NC組。但是在miR-224模擬劑組中,E-cadherin的蛋白表達(dá)顯著低于NC組(t=6.005,P=0.004);而間質(zhì)標(biāo)記物N-cadherin(t=5.606,P=0.005)和vimentin(t=4.151,P=0.014)的蛋白表達(dá)顯著高NC組(見(jiàn)圖3,4)。由此可見(jiàn),抑制miR-224可以抑制宮頸癌細(xì)胞的EMT,而過(guò)表達(dá)miR-224可以促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的EMT。

圖3 不同組別細(xì)胞E-cadherin、N-cadherin、vimentin蛋白表達(dá)灰度Figure 3 Expression of E-cadherin, N-cadherin, and vimentin proteins in different groups by Western blot

3 討論

宮頸癌是女性常見(jiàn)的生殖系統(tǒng)腫瘤。近年來(lái),發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì),更加年輕化。早期診斷及治療被認(rèn)為是降低宮頸癌死亡率、提高患者生存質(zhì)量的重要措施。miR作為一種具有廣泛調(diào)節(jié)能力的信號(hào)分子,具有癌基因或抑癌基因的作用,通常促癌miRs在腫瘤中表達(dá)上調(diào),通過(guò)解除抑癌基因調(diào)控,阻止細(xì)胞的分化,調(diào)控細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化,還可以通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞增殖等多種途徑來(lái)促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。有研究[7]證實(shí)miR在宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展中起到重要作用。miR-224作為miR家族的一員,已經(jīng)被證實(shí)在髓母細(xì)胞瘤、乳腺癌等多種腫瘤中發(fā)揮促癌效應(yīng)[8,9]。陳文波等[6]研究結(jié)果顯示miR-224在宮頸癌組織中表達(dá)上調(diào),且表達(dá)越高,腫瘤分化越低,患者預(yù)后越差,Shen等[10]研究結(jié)果與陳文波等[6]研究結(jié)果具有一致性,進(jìn)一步佐證了miR-224在宮頸癌組織具有促癌作用。本研究亦證實(shí),miR-224在宮頸癌患者的組織中及宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)明顯增加,且過(guò)表達(dá)miR-224可以顯著增加宮頸癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力?？赡茉蛴?①miR-224可通過(guò)激活A(yù)KT信號(hào)傳導(dǎo)和直接靶向腫瘤抑制基因PPP2R1B促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲[11,12]和rho GTP酶活化蛋白ARHGAP9和ARHGAP21,其使CDC42失活[13]。②miR-224可以通過(guò)直接或間接調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶來(lái)影響侵襲和轉(zhuǎn)移,所述基質(zhì)金屬蛋白酶是癌細(xì)胞分泌的酶,其降解細(xì)胞外基質(zhì)并有助于傳播。③miR-224可能在調(diào)節(jié)EMT中起作用,EMT作為癌細(xì)胞增殖、遷移與侵襲能力增加的重要機(jī)制,在宮頸癌中發(fā)揮的相應(yīng)作用近來(lái)受到越來(lái)越多學(xué)者的重視[14]。EMT的實(shí)質(zhì)是調(diào)控肌動(dòng)蛋白絲的動(dòng)態(tài)裝配,因此,上皮標(biāo)志物(E-cadherin)的表達(dá)下調(diào),而間質(zhì)標(biāo)志物(N-cadherin、vimentin)的表達(dá)上調(diào)被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞獲得EMT的重要標(biāo)志[15,16]。同時(shí)miR可以通過(guò)啟動(dòng)后機(jī)制、共翻譯蛋白降解機(jī)制、啟動(dòng)機(jī)制、miR介導(dǎo)的mRNA降解等多種途徑[17]調(diào)控細(xì)胞的EMT。本研究在宮頸癌患者蛋白水平在發(fā)現(xiàn)EMT標(biāo)志物表達(dá)改變,過(guò)表達(dá)miR-224可以下調(diào)E-cadherin的表達(dá),促進(jìn)N-cadherin與vimentin的表達(dá),進(jìn)一證實(shí)了miR-224可能在宮頸癌的發(fā)病中起到促癌作用,為宮頸癌治療提供新的治療思路。但由于本次納入的樣本數(shù)較少,仍需要更大樣本的研究來(lái)進(jìn)一步證實(shí)。

與NC組相比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001圖4 EMT標(biāo)志物E-cadherin、N-cadherin、vimentin蛋白表達(dá)灰度分析Figure 4 E-cadherin, N-cadherin and vimentin protein expression in different groups

綜上所述,miR-224通過(guò)促進(jìn)N-cadherin與vimentin的表達(dá),抑制E-cadherin的表達(dá),調(diào)控宮頸癌細(xì)胞的EMT,促進(jìn)宮頸癌的增殖、侵襲和遷移。在宮頸癌中,miR-224可能發(fā)揮促癌作用,為宮頸癌治療提供新的治療思路。