化合物968對類風濕性關節(jié)炎成纖維細胞樣滑膜細胞的增殖和凋亡的影響及其機制

劉亞明,葛賢明,郭 濱,甄 誠,魏 芳,韋穎梅,劉 浩

(蚌埠醫(yī)學院藥學院,安徽省生化藥物工程技術研究中心,蚌埠 233030;*通訊作者,E-mail:liuhao6886@foxmail.com;#共同通訊作者,E-mail:bbmcwym@163.com)

類風濕性關節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是以滑膜中的免疫細胞浸潤和增殖為特征的系統(tǒng)性自身免疫性疾病[1],致殘率高,發(fā)病機制尚未完全清楚。有研究表明:在RA疾病的發(fā)生發(fā)展中活化的成纖維細胞樣滑膜細胞起著至關重要的作用,其通過產(chǎn)生炎癥介質(zhì)而導致滑膜炎癥和軟骨損傷[2]。近年來,靶向促炎細胞因子和免疫細胞的生物療法的發(fā)展大大改善了RA的治療,然而一些患者對這些治療仍然耐受。因此尋求抑制RA-FLS增殖的新療法替代或補充現(xiàn)有的RA治療顯得尤為重要。正常細胞能量供給主要依賴于氧化磷酸化,而腫瘤細胞則更多依賴于產(chǎn)能效率較低的糖酵解和谷氨酰胺代謝[3,4]。由糖酵解途徑產(chǎn)生的丙酮酸被轉(zhuǎn)化為乳酸鹽,而不是用于三羧酸循環(huán),從而使進入TCA的底物不足,難以維持后續(xù)物質(zhì)的合成。此時,腫瘤細胞會通過大量的攝入谷氨酰胺回補TCA循環(huán)[5,6]。大量研究已經(jīng)證明靶向能量代謝為腫瘤的治療提供了新的治療策略[6-10]。而相關研究表明,在富含氧自由基、NO和細胞因子的微環(huán)境中,RA-FLS表現(xiàn)出多種腫瘤細胞樣特征[11],化合物968是谷氨酰胺酶1(glutaminase 1,GLS1)抑制劑[12],能夠特異性抑制谷氨酰胺代謝,由于GLS1在RA-FLS細胞中呈高表達,且谷氨酰胺缺乏實驗可抑制RA-FLS的生長[13]。本實驗旨在研究化合物968對RA-FLS細胞增殖和相關蛋白的表達的影響,并探究其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自美國Gibco公司,胎牛血清購自浙江天杭生物科技公司,化合物968購自美國MedChemExpress(MCE)公司,MTT購自Biosharp公司,Annexin-Ⅴ/PI雙染試劑盒購自貝博生物公司,Mcl-1、Bax、β-actin抗體購自Proteintech公司,HRP標記的山羊抗小鼠IgG、山羊抗兔IgG購自博士德生物工程公司,DAPI試劑購自碧云天生物技術公司。

1.2 細胞株

類風濕性關節(jié)炎成纖維細胞樣滑膜細胞(RA-FLS)購自BeNa Culture Collection(BNCC),蚌埠醫(yī)學院生化藥理研究室凍存。培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中,置37 ℃、飽和濕度、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.3 MTT比色法檢測細胞增殖

取對數(shù)生長期的RA-FLS細胞接種于96孔板,每孔6×103個細胞。在培養(yǎng)箱中過夜,待細胞充分貼壁,棄去上清液,加入含有不同濃度(5,10,20,40,80 μmol/L)的化合物968的培養(yǎng)液,設置調(diào)零孔,每組設5個復孔,分別培養(yǎng)24,48,72 h,然后每孔加入15 μl MTT溶液繼續(xù)孵育4 h,棄上清液,每孔加入150 μl二甲基亞砜,37 ℃溫箱孵育30 min,振蕩使結晶物充分溶解,用酶標儀測定490 nm波長下的吸光度(OD)值,計算細胞的生存率。

1.4 倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)

將對數(shù)生長期的RA-FLS細胞以3.0×105/孔的密度接種于6孔板中。放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,分組加入不同濃度的化合物968,刺激細胞48 h,使用倒置顯微鏡觀察RA-FLS細胞形態(tài)的變化。

1.5 DAPI染色檢測細胞核的變化

將對數(shù)生長期的RA-FLS細胞以3.0×105/孔接種于6孔板培養(yǎng)24 h,使用不同濃度藥物分組給藥,藥物刺激細胞24 h,棄上清液,PBS洗滌2次,用4%多聚甲醛充分固定10 min,PBS洗滌3次,每孔加入600 μl DAPI染色液避光反應15 min,棄上清,PBS洗滌3次,每次5 min,通過活細胞工作站觀察細胞核形態(tài)學變化。

1.6 Annexin-Ⅴ/PI雙染法

收集細胞,離心后棄上清,用PBS洗滌細胞2次,然后用400 μl 1×Annexin Ⅴ結合液懸浮細胞,調(diào)整至1×106/ml濃度,轉(zhuǎn)至5 ml流式專用試管中,加入5 μl Annexin Ⅴ-FITC染色15 min,再加入10 μl PI染色液?；靹蚝蟊芄夥跤? min,1 h內(nèi)用流式細胞儀檢測。

1.7 Western blot檢測凋亡相關蛋白Mcl-1、Bcl-2及Bax的表達

將RA-FLS細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板中,每孔3×105個細胞,培養(yǎng)至80%匯合后,換含有濃度為10,20,40,80 μmol/L的化合物968的培養(yǎng)液刺激細胞。培養(yǎng)72 h收集細胞,每孔加入預冷的蛋白裂解液,冰上裂解30 min,提取細胞總蛋白,4 ℃離心30 min,上清液轉(zhuǎn)移至1.5 ml EP管中。采用BCA法定量。每組取60 μg蛋白進行12% SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)膜至PVDF膜,室溫封閉2-3 h,一抗4 ℃過夜,TBST洗膜3次,二抗室溫孵育2 h,TBST洗膜3次,加ECL顯影液,Bio-Rad凝膠成像儀成像。

1.8 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 化合物968對RA-FLS細胞存活率的影響

MTT檢測結果表明,化合物968在5-80 μmol/L的濃度范圍可明顯降低RA-FLS細胞的存活率,隨著藥物濃度的增加,RA-FLS細胞的存活率顯著下降,且呈時間和濃度依賴性。經(jīng)計算,化合物968作用于RA-FLS細胞24,48,72 h的IC50值分別為48.45,35.66,20.95 μmol/L(見圖1)。

與0 μmol/L組相比,**P<0.01圖1 化合物968對RA-FLS細胞存活率的影響Figure 1 The proliferation rate of RA-FLS after treated with Compounds 968

2.2 化合物968對RA-FLS細胞形態(tài)學的影響

0-80 μmol/L化合物968作用于RA-FLS細胞48 h在倒置顯微鏡下觀察,對照組(0 μmol/L)細胞生長良好,細胞呈梭形,輪廓清晰,胞質(zhì)飽滿,而給藥組隨著給藥濃度增加,大量細胞表面有棕褐色絮狀物質(zhì)形成,并未見漂浮細胞,細胞密度隨著藥物濃度增加而減少,細胞增殖受到明顯抑制(見圖2)。

2.3 化合物968誘導RA-FLS細胞凋亡的作用

為了明確在RA-FLS細胞中化合物968是否可以誘導細胞凋亡,實驗首先采用Annexin-Ⅴ/PI雙染法檢測細胞早期凋亡率。結果顯示,20,40,80 μmol/L化合物968作用于細胞24 h早期凋亡率分別為7.95%± 1.90%,14.6%± 1.70%,21.50%± 2.30%,顯著高于0 μmol/L組(2.80%± 0.60%,P<0.01,見圖3A)。

0-80 μmol/L化合物968處理細胞24 h,DAPI染色檢測化合物968作用細胞后細胞核的形態(tài)變化。實驗結果顯示,對照組細胞胞核均勻淡染,胞膜完整,胞核形態(tài)呈橢圓型,而給藥組細胞膜通透性增加,胞核濃集、邊緣化,隨著藥物濃度增加,細胞核出現(xiàn)濃染不規(guī)則致密的固縮形態(tài)逐漸增加,甚至有細胞核碎裂(見圖3B,白色三角形所示)。

2.4 化合物968對RA-FLS細胞Bax和Mcl-1蛋白表達的影響

實驗結果表明,20,40,80 μmol/L的化合物968作用于細胞48 h,抗凋亡蛋白Mcl-1的表達水平降低,促凋亡蛋白Bax的表達上調(diào)(見圖4)。這說明,化合物968可以通過影響凋亡相關蛋白的表達從而引起RA-FLS細胞的凋亡。

圖2 化合物968對RA-FLS細胞形態(tài)的影響Figure 2 Effect of compound 968 on the morphology of RA-FLS cells

圖3 化合物968誘導RA-FLS細胞凋亡的作用Figure 3 The effect of compound 968 on apoptosis of RA-FLS cells

與0 μmol/L組相比,**P<0.01,***P<0.001圖4 RA-FLS細胞中Bax和Mcl-1的表達情況Figure 4 The expression level of Bax and Mcl-1 in RA-FLS cells

3 討論

類風濕關節(jié)炎成纖維細胞樣滑膜細胞在富含氧自由基、一氧化氮和細胞因子的環(huán)境中具有自主生存的能力,類似于某些腫瘤的表型[13]。谷氨酰胺是細胞生長和能量代謝中另一種很重要的碳源[14-16]。HeLa和基底型乳腺癌細胞等幾種癌細胞,相比葡萄糖更喜歡把谷氨酰胺作為其能量來源[11,17,18]。谷氨酰胺可作為合成大分子的前體,是呼吸的主要能量來源[19-21]。在腫瘤細胞中,由糖酵解途徑產(chǎn)生的丙酮酸被轉(zhuǎn)化為乳酸鹽,而不是用于三羧酸(TCA)循環(huán),從而使進入TCA的底物不足,不足以維持后續(xù)物質(zhì)的合成。此時,腫瘤細胞會通過大量的攝入谷氨酰胺[22],在谷氨酰胺酶的作用下將其轉(zhuǎn)化成谷氨酸,并在谷氨酰胺脫氫酶的作用下轉(zhuǎn)變成α-酮戊二酸,從而回補TCA循環(huán)[4]。對于腫瘤細胞來說,谷氨酰胺是線粒體中最基本的底物,對維持線粒體的膜電位和完整性,特別是大分子物質(zhì)的合成上起重要作用[5]。為了補償這些變化并保持功能性TCA循環(huán),癌細胞通常升高對谷氨酰胺水平的依賴性[17,23]。相關研究表明,RA-FLS表現(xiàn)出幾種腫瘤細胞樣特征,如RA發(fā)炎的關節(jié)的微環(huán)境以低氧和低營養(yǎng)濃度為特征[24]。有研究已經(jīng)闡述了RA-FLS中的代謝變化,如代謝組分析已顯示RA-FLS和骨關節(jié)炎成纖維細胞樣滑膜細胞(OA-FLS)之間不同的代謝組學[25]。代謝組學結果表明,RA-FLS中糖代謝、脂肪分解和氨基酸代謝的改變與滑膜增生和炎癥有關。此外,葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1(Glut1)、膽堿激酶、單羧酸轉(zhuǎn)運蛋白4(MCT4)的抑制劑均已顯示出能抑制RA-FLS增殖和/或改善小鼠炎性關節(jié)炎[26-28]。從RA-FLS中發(fā)現(xiàn)的代謝組學改變揭示了風濕性疾病發(fā)病的新機制,靶向代謝功能障礙可能會為RA的治療提供新的策略。

谷氨酰胺酶是谷氨酰胺代謝過程中的關鍵限速酶,它的抑制會導致進入到TCA循環(huán)的底物不足。常見的谷氨酰胺酶抑制劑有BPTES和化合物968。化合物968[12]是最近發(fā)現(xiàn)的第二類變構GAC(glutaminase C)抑制劑,對抑制癌細胞生長具有高度特異性。Bcl-2家族蛋白是細胞凋亡的重要調(diào)控因子,包括凋亡抑制蛋白和凋亡誘導蛋白,前者主要有Bcl-2、Mcl-1、Bcl-XL等,后者主要為Bax、Bak、Bad等[29]。

首先,我們通過MTT實驗明確化合物968對RA-FLS細胞存活率的影響呈時間和濃度依賴性。

接著,我們使用倒置顯微鏡和DAPI染色分別觀察了化合物968對滑膜細胞形態(tài)學和細胞核形態(tài)的影響,均發(fā)現(xiàn)化合物968可以顯著抑制RA-FLS細胞增殖。隨后,我們?yōu)榱嗣鞔_化合物968是否可以誘導滑膜細胞凋亡,我們使用流式細胞儀采用雙染法檢測化合物968對滑膜細胞早期凋亡的影響,我們發(fā)現(xiàn)化合物968可以誘導RA-FLS細胞凋亡,且早期凋亡率隨著藥物濃度的增加而增加。最后,為了進一步明確化合物968誘導細胞凋亡的可能性機制,我們通過Western blot檢測相關凋亡蛋白,結果表明,化合物968可以通過影響凋亡相關蛋白的表達從而引起類風濕關節(jié)炎滑膜細胞的凋亡。

綜合以上研究我們發(fā)現(xiàn):化合物968可以呈時間和濃度依賴性的降低RA-FLS細胞的存活率,并可以誘導細胞發(fā)生凋亡,其可能的機制是調(diào)節(jié)細胞凋亡相關蛋白Mcl-1和Bax的表達。本研究我們可以發(fā)現(xiàn)靶向谷氨酰胺代謝可能會為RA的治療提供新的思路。