樣本溶血對血漿中16種氨基酸測定準(zhǔn)確性的探究

陳逢斌 任瑩 趙勝軍

摘要：為探究樣本溶血對國標(biāo)酸解法測定血漿中16種氨基酸含量的影響，采集60份斷奶仔豬頸動脈血液并分為3組，即普通溶血組、機(jī)械溶血組與對照組，普通溶血組為血液采集后溶血樣本，機(jī)械溶血組為血液采集后經(jīng)超聲波處理溶血再離心樣本，未溶血血漿為對照組。采用賽卡姆S433D全自動氨基酸分析儀檢測血漿樣本中天冬氨酸（Asp）、蘇氨酸（Thr）、絲氨酸（Ser）、谷氨酸（Glu）、甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、纈氨酸（Val）、蛋氨酸（Met）、異亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）、脯氨酸（Pro）、賴氨酸（Lys）、組氨酸（His）、精氨酸（Arg）的含量。結(jié)果表明，普通溶血組Asp、Ala、Val、Leu、His、Lys含量相較于其余兩組顯著升高（P<0.05），其余10種氨基酸含量相較于對照組偏高或偏低（P>0.05）。說明血樣溶血對其氨基酸含量存在較大影響，且受非血紅蛋白因素影響較小，為了盡可能避免或減少溶血的發(fā)生，建議采血操作以及樣品的運(yùn)送、分離檢測嚴(yán)格規(guī)范，以提高測定的準(zhǔn)確性。

關(guān)鍵詞：血漿；溶血；氨基酸；準(zhǔn)確性

中圖分類號：R446.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1007-273X（2019）02-0005-03

血液樣本溶血會直接導(dǎo)致生化指標(biāo)檢測出現(xiàn)偏差，從而引發(fā)測定誤差以及其他問題[1]。近年來，在醫(yī)療領(lǐng)域中血液氨基酸指標(biāo)可用于篩查苯丙酮尿癥、先天性甲狀腺功能低下等疾病[2]，科研中作為血液標(biāo)記物輔助診斷中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤以及胃癌[3，4]，并可用于評估動物腸道健康以及營養(yǎng)物質(zhì)代謝水平[5，6]。血液的特殊性致使測試血漿樣本彌足珍貴，而在實(shí)際操作中卻因溶血問題導(dǎo)致樣本被棄用或者測定值不可用，給醫(yī)療和科研帶來巨大損失。因此，探究血液樣本溶血對其氨基酸含量的影響并加以分析能夠使篩查或者評估更加精準(zhǔn)。吳小平[7]對溶血導(dǎo)致臨床生化檢驗(yàn)結(jié)果偏差進(jìn)行了研究，表明溶血對血液中葡萄糖、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、尿酸等有顯著影響。大量研究表明，溶血因素對血液指標(biāo)測定準(zhǔn)確性有較大影響，而分析原因后提出的校正方法主要是規(guī)避采血時(shí)的不規(guī)范操作，并利用回歸方程校準(zhǔn)數(shù)據(jù)[8-10]。在此基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)對血液樣本溶血對茚三酮柱后衍生法測定氨基酸含量的影響以及是否因非蛋白基底因素影響氨基酸含量進(jìn)行了探討，并根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果對溶血樣品氨基酸測定進(jìn)行了分析并提出了解決對策。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)所用血液樣本來自30頭21日齡斷奶仔豬。

1.2 儀器和試劑

Sykam S433D全自動氨基酸測試儀，試劑均為Sigma試劑公司生產(chǎn)。

1.3 方法

將60份血液樣本分為3組，即普通溶血組、機(jī)械溶血組及對照組，對照組為未溶血樣本制得血漿，普通溶血組為采血后發(fā)生溶血樣本制得血漿，機(jī)械溶血組為未溶血樣本經(jīng)超聲波處理后再離心制得血漿。以超聲波進(jìn)行機(jī)械處理模擬因物理因素導(dǎo)致的溶血[11]，離心后從而排除溶血后血紅蛋白因素的影響，探究是否因非血紅蛋白物質(zhì)及其他因素導(dǎo)致血液溶血后對氨基酸含量測定造成影響。

1.4 試驗(yàn)原理

酸水解法測定氨基酸具體方法按照GB/T 18246-2000執(zhí)行[12]，測定血漿中天冬氨酸（Asp）、蘇氨酸（Thr）、絲氨酸（Ser）、谷氨酸（Glu）、甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、纈氨酸（Val）、蛋氨酸（Met）、異亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）、脯氨酸（Pro）、賴氨酸（Lys）、組氨酸（His）、精氨酸（Arg）的含量。

1.5 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Excel 2013統(tǒng)計(jì)整理，采用SAS軟件包并選擇GLM模型對數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA單因素方差分析。分析結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，以P<0.05為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

茚三酮柱后衍生測定水解氨基酸含量結(jié)果見表1。由表1可見，相較于對照組不溶血樣本以及機(jī)械溶血組超聲波溶血樣本，普通溶血組即采集后發(fā)生溶血的血漿中Asp、Ala、Val、Leu、His、Lys含量顯著升高（P<0.05），且Thr、Ser、Glu、Gly、Phe、Pro、Arg的含量也偏高（P>0.05）；普通溶血組的Tyr、Met、Ile含量低于或等于對照組，但與機(jī)械溶血組無顯著性差異（P>0.05）。機(jī)械溶血組的Asp、Thr、Ser、Glu、Gly、Ala、Val、Leu、Phe、Pro、Lys、His、Arg含量均與對照組無顯著性差異（P>0.05），但Tyr、Met、Ile含量卻低于對照組（P>0.05）。

3 討論

溶血，即紅細(xì)胞破裂，致使血紅蛋白散出到血漿或者血清中[13]。其主要表現(xiàn)為血漿或者血清顏色和密度的變化，一般為粉紅色或者紅色，溶血血漿中血紅蛋白和其他生理成分增加，其密度受到影響[14]。而血紅蛋白主要成分也是蛋白物質(zhì)，在酸解法下分解為氨基酸或者小肽，導(dǎo)致血漿中氨基酸測定值偏高，這與本試驗(yàn)的大致趨勢一致。動物機(jī)體中的Asp主要參與細(xì)胞代謝和生理作用，直接作用在于合成嘌呤、嘧啶以及其余可轉(zhuǎn)氨作用合成的氨基酸[15]；而Ala主要參與能量供應(yīng)的糖異生過程以及葡萄糖-丙氨酸循環(huán)，并在器官間的碳氮代謝和運(yùn)輸中起到重要作用[16]；Val作為生糖氨基酸可以進(jìn)入三羧酸循環(huán)進(jìn)行供能，且為蛋白質(zhì)合成前體物質(zhì)[17]；Leu主要功能為促進(jìn)蛋白質(zhì)合成[18]；His則直接為肌蛋白和球蛋白的組成成分[19]；Lys作為豬的第一限制性氨基酸可直接參與氮代謝中NO的合成[15]。這6個(gè)氨基酸涉及到機(jī)體各個(gè)器官的供能與氮代謝，從而也就說明為什么本試驗(yàn)中普通溶血組Asp、Ala、Val、Leu、His、Lys含量相較于對照組顯著升高。但是普通溶血組中Met、Ile、Tyr的含量卻小于或等于對照組，這可能與機(jī)體各個(gè)組織器官細(xì)胞的氨基酸基底含量和吸收利用量有很大關(guān)聯(lián)[20]。而本試驗(yàn)中機(jī)械溶血組除Met、Ile、Tyr以外的其余13種氨基酸含量均與對照組無明顯差異，由此可見在溶血過程中由非蛋白基底物質(zhì)因素引起的變異較小，更多的可能來源于蛋白基底物質(zhì)、采血速度或者采血時(shí)產(chǎn)生的泡沫等其他方面[21]。

溶血發(fā)生的原因比較復(fù)雜，有可能發(fā)生在采集過程中或者采集后儲存過程中抑或是測定過程中[21]。首先可以明確的是，血漿的來源也就是動物機(jī)體的免疫狀態(tài)對血漿中的各種應(yīng)激物質(zhì)或激素水平有很大影響；其次，在血液樣本采集過程中有很多原因可以導(dǎo)致溶血：抽血針頭大小、采集位點(diǎn)、進(jìn)針角度、抽血速度、血液聚集過程中的泡沫問題以及運(yùn)送過程的顛簸等；再者，儲存不當(dāng)或重復(fù)凍融以及解凍時(shí)的外界溫度都可以對血液的溶血產(chǎn)生影響。而在實(shí)際血樣指標(biāo)測定過程中，有更多問題可以影響到最終結(jié)果，如測定周期長而且可能涉及到轉(zhuǎn)移多次等問題。這也很好地印證了在某一項(xiàng)臨床試驗(yàn)中調(diào)查顯示溶血樣本達(dá)到1.98%這一結(jié)果[22]。

總而言之，溶血的原因眾多，但在國標(biāo)水解法測定血漿中氨基酸的試驗(yàn)中大致可以排除血紅素以及其他非血紅蛋白因素的影響，更多的可能與紅細(xì)胞破裂后釋放的血紅蛋白以及蛋白基底因素密切相關(guān)。以此對血漿樣品氨基酸含量的測定提出建議：①動物試驗(yàn)中保證可控因素一致，減少機(jī)體免疫誤差。②采集血樣時(shí)統(tǒng)一位點(diǎn)并熟練操作、進(jìn)針角度控制以及時(shí)刻關(guān)注血液流出速度、運(yùn)送過程中確保平穩(wěn)。③統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)化儲存、減少凍融次數(shù)。④減少轉(zhuǎn)樣次數(shù)，并及時(shí)上機(jī)測定。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)得出如下結(jié)論：①相較于正常血漿，溶血樣本中16種氨基酸含量絕大部分顯著升高。②進(jìn)一步研究表明溶血樣本中非血紅蛋白因素對氨基酸含量的影響較小。

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