水飛薊賓改善APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠認(rèn)知能力氧化應(yīng)激相關(guān)機(jī)制研究

張禮茜，陳雪瑩，范碧蓮，李文博，殷浩然，顧子琨，崔巖，袁月鳴，孟禹彤，方葉，金戈

（1.沈陽醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)2015、2016級，遼寧 沈陽 110034；2.公共衛(wèi)生學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)專業(yè)2015級；3.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室）

阿爾茨海默病（Alzheimer′s disease，AD）是癡呆的一種常見類型，臨床表現(xiàn)為認(rèn)知和記憶功能不斷惡化，日常生活能力進(jìn)行性減退，并有各種神經(jīng)精神癥狀和行為障礙［1］。全球現(xiàn)有3 500多萬癡呆患者，每年新增病例460萬。65歲以上老年人的發(fā)病率每5年翻一番。到2040年，全球癡呆病例將達(dá)到8 110萬［2］。AD成為目前危害老年人健康最常見的疾病之一，給家庭帶來沉重的精神及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。然而目前治療AD的藥物有限，獲得美國FDA批準(zhǔn)的臨床藥物包括膽堿酯酶抑制劑和NMDA受體拮抗劑等［3］。因此，研發(fā)新的治療AD的藥物十分迫切。從中藥天然產(chǎn)物中篩選安全、有效、多靶點的藥物為AD治療提供新思路成為研究熱點。水飛薊賓（silibinin）是菊科植物水飛薊果實中提取的黃酮木脂類化合物的最主要成分，臨床上用于治療急慢性肝炎、肝硬化及中毒性肝損傷［4］。有文獻(xiàn)報道水飛薊賓能夠改善學(xué)習(xí)記憶障礙，但機(jī)制尚未明確。本研究采用APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)一步評價水飛薊賓提高學(xué)習(xí)記憶能力及探討相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 6月齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠，雄性，體重（30±2）g，由北京華阜康生物技術(shù)有限公司提供，實驗動物合格證號：SCXK（京）2014-0004。將實驗動物按體重隨機(jī)分為模型組、美金剛組、水飛薊賓低和高劑量組；另選取平行月齡C57BL/6J小鼠為空白對照組，每組10只。實驗動物飼養(yǎng)環(huán)境溫度22～24℃，濕度60%左右，自由攝食飲水，12 h循環(huán)光照。實驗動物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后。空白對照組和模型組給予生理鹽水，美金剛組給予2.6 mg/kg美金剛，水飛薊賓低、高劑量組分別給予100 mg/kg、200 mg/kg水飛薊賓，每天灌胃一次，連續(xù)灌胃給藥6周余，行為學(xué)實驗時期繼續(xù)給藥。

1.2 藥品及試劑 水飛薊賓（湖南協(xié)力藥業(yè)有限公司，批號20130804）；美金剛（丹麥靈北藥廠，進(jìn)口藥品注冊證號H20120268）；丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）ELISA試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技有限公司，E-EL-0026c、E-EL-0060c、EEL-M2398c）；突觸素（synaptophysin，SYP）、生長 相 關(guān) 蛋 白（growth-associated protein 43，GAP-43）ELISA試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技有限公司）。

1.3 儀器及裝置 Morris水迷宮裝置及檢測分析系統(tǒng)（成都泰盟軟件有限公司）；酶標(biāo)定量測試儀（奧地利特TECAN公司）；-80℃低溫冰箱（中科美菱）；低溫超速離心機(jī)（美國BECK?MAN公司）；機(jī)械勻漿機(jī)（上海凈信科技公司）；透射電鏡（日本電子株式會社）。

1.4 方法

1.4.1 Morris水迷宮實驗 Morris水迷宮實驗裝置為一個直徑為100 cm白色圓形水池及一個直徑約10 cm的安全平臺。水溫22～24℃。實驗分為三部分：（1）適應(yīng)環(huán)境，在無安全平臺的情況下每只小鼠自由探索1 min。（2）定向航行：將安全臺放置在第四象限，將小鼠從不同入水口放入水中，電腦同時進(jìn)行數(shù)據(jù)采集并記錄其找到安全平臺的時間（逃避潛伏期），小鼠在安全平臺停留5 s后采集自動停止。數(shù)據(jù)采集時間為60 s，小鼠每天訓(xùn)練2次，連續(xù)訓(xùn)練5 d。（3）空間探索：定向航行試驗結(jié)束后，撤除安全平臺，將小鼠放入水池中，自由探索60 s，第6天進(jìn)行。攝像系統(tǒng)在規(guī)定時間內(nèi)記錄小鼠在安全平臺所在象限游泳的時間、路程及穿越安全平臺所在位置的次數(shù)等指標(biāo)。本研究采用定向航行游泳距離、空間探索目標(biāo)象限停留時間百分比分析水飛薊賓改善學(xué)習(xí)記憶障礙的作用。

1.4.2 ELISA 法檢測小鼠腦皮質(zhì)組織中 MDA、GSH、SOD含量 將小鼠腦皮質(zhì)組織10～20 mg以1∶10的體積比加入磷酸鹽緩沖液，組織勻漿；3 000×g離心2次，每次10 min，取上清液。按照ELISA試劑盒說明書操作，檢測MDA、GSH、SOD含量。

1.4.3 電鏡下觀察小鼠突觸的超微結(jié)構(gòu) 將小鼠腦海馬組織固定后進(jìn)行脫水包埋，先用0.1 mol/L磷酸漂洗液漂洗3次，每次5 min；然后用1%鋨酸固定液固定后，經(jīng)梯度酒精、丙酮處理后包埋。將包埋后的組織樣本進(jìn)行固化，超薄切片機(jī)切片50 nm，3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，透射電鏡下觀察。

1.4.4 ELISA法檢測小鼠腦皮質(zhì)組織中突觸相關(guān)蛋白SYP、GAP-43的表達(dá) 組織處理同1.4.2。具體按照ELISA試劑盒說明書操作，檢測SYP、GAP-43的表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩兩比較采用最小顯著性差異法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 水飛薊賓對APP/PS1小鼠水迷宮實驗游泳距離及目標(biāo)象限停留時間百分比的影響 與對照組比較，模型組小鼠的游泳距離顯著增加（P＜0.05），目標(biāo)象限停留時間百分比顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，水飛薊賓100 mg/kg、200 mg/kg組及美金剛組小鼠游泳距離顯著減少，目標(biāo)象限停留時間百分比顯著增加（P＜0.05）。見表1。

表1 水飛薊賓對APP/PS1小鼠Morris水迷宮游泳距離及目標(biāo)象限停留時間百分比的影響（n=10）

2.2 水飛薊賓對APP/PS1小鼠腦皮質(zhì)組織中MDA、GSH和SOD含量的影響 與空白對照組比較，模型組小鼠腦皮質(zhì)組織中MDA含量顯著升高，SOD和GSH含量顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，水飛薊賓組小鼠腦皮質(zhì)組織中的MDA含量顯著降低，水飛薊賓200 mg/kg組SOD和 GSH含量顯著增加（P＜0.05），水飛薊賓 100 mg/kg組GSH含量顯著增加（P＜0.05）。見表2。

表2 水飛薊賓對APP/PS1小鼠腦皮質(zhì)組織中MDA、GSH和SOD含量的影響（n=5）

2.3 水飛薊賓對APP/PS1小鼠突觸超微結(jié)構(gòu)的改善作用 透射電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，對照組突觸數(shù)量較多，突觸前膜內(nèi)突觸小泡含量豐富，突觸間隙清楚，突觸后致密物厚度較大且均勻。與對照組比較，模型組突觸數(shù)量減少，突觸結(jié)構(gòu)模糊，前后膜融合，小泡含量較少，突觸后致密物厚度較薄。與模型組相比，水飛薊賓200 mg/kg組突觸數(shù)量較多，突觸結(jié)構(gòu)較為清晰，突觸間隙明顯，可見豐富的突觸小泡和較厚的突觸后致密物。見圖1。

2.4 水飛薊賓對APP/PS1小鼠腦皮質(zhì)組織中突觸相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與對照組比較，模型組小鼠腦皮質(zhì)組織中SYP和GAP-43蛋白表達(dá)含量均顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，水飛薊賓低、高劑量組腦皮質(zhì)組織中SYP以及水飛薊賓200 mg/kg組GAP-43蛋白表達(dá)含量均顯著升高（P＜0.05）。見表3。

圖1 透射電鏡下水飛薊賓對APP/PS1小鼠腦突觸超微結(jié)構(gòu)的改善作用（×20 000）

表3 水飛薊賓對APP/PS1小鼠腦皮質(zhì)組織中突觸相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（n=5）

3 討論

水飛薊素主要含有水飛薊賓、異水飛薊賓、水飛薊亭及水飛薊寧等活性成分，其中，以水飛薊賓活性最強(qiáng)、含量最高。研究顯示，水飛薊素能消除體內(nèi)活性氧，對抗脂質(zhì)過氧化、肝纖維化，是各種病毒性肝炎、肝纖維化、酒精性肝損害以及其他中毒代謝性肝損害的有效治療藥物。水飛薊素可以顯著改善海馬注射Aβ1-40大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙，通過降低APP表達(dá)，抑制Aβ斑塊的形成［5-6］；抑制LPS誘導(dǎo)脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞分泌iNOS［7］。氧化應(yīng)激能夠通過增加APP的表達(dá)，調(diào)節(jié)β分泌酶和γ分泌酶的活性，促進(jìn)Aβ的生成。Aβ寡聚體能促進(jìn)Tau蛋白的磷酸化，形成神經(jīng)原纖維纏結(jié)（NFT）。Aβ在胞外沉積形成的老年斑（SP）和NFT會進(jìn)一步促進(jìn)氧化應(yīng)激反應(yīng)并延長炎癥反應(yīng)，對神經(jīng)元造成不可逆的損傷并最終導(dǎo)致神經(jīng)元的死亡［8-9］。突觸作為神經(jīng)元之間信息傳遞的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，具有改變其長度和結(jié)構(gòu)的能力，稱為突觸可塑性，是腦內(nèi)學(xué)習(xí)和記憶的神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)［10］。SYP是突觸囊泡最豐富的蛋白之一，超過90%的突觸囊泡都含有SYP，可作為反映突觸密度的標(biāo)志［11］。SYP在突觸囊泡轉(zhuǎn)運、與突觸前膜錨靠、融合并釋放神經(jīng)遞質(zhì)中起重要作用。SYP能夠促進(jìn)囊泡離開網(wǎng)狀細(xì)胞骨架，移向突觸前膜并與之融合。SYP對鈣離子依賴性的神經(jīng)遞質(zhì)（乙酰膽堿和谷氨酸等）的釋放過程中起著重要作用［12-13］。AD患者SYP減少與認(rèn)知功能下降密切相關(guān)［14-15］。GAP-43對神經(jīng)發(fā)育、軸突的再生、突觸的發(fā)生、信號傳導(dǎo)及神經(jīng)遞質(zhì)的釋放均起著重要作用［16-17］。神經(jīng)損傷后軸突再生和反應(yīng)性突觸形成都伴隨著GAP-43表達(dá)增加，GAP-43可作為突觸可塑性的一個標(biāo)志物［18］。Morris水迷宮實驗是行為藥理學(xué)中最常用的測試方法之一，常被用來評估嚙齒類動物的空間學(xué)習(xí)記憶能力［19-20］。文獻(xiàn)報道水飛薊賓顯著減少AD模型小鼠逃避潛伏期及游泳距離［19］。

本實驗結(jié)果顯示，水飛薊賓可顯著改善APP/PS1小鼠Morris水迷宮空間探索中游泳距離、定向航行目標(biāo)象限停留時間百分比等指標(biāo)。形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示水飛薊賓200 mg/kg能夠顯著修復(fù)突觸超微結(jié)構(gòu)損傷的作用；另外，水飛薊賓200 mg/kg可促進(jìn)突觸相關(guān)蛋白SYP、GAP-43的表達(dá)，減少APP/PS1小鼠腦中脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量，增加SOD及GSH的含量，抑制氧化應(yīng)激。水飛薊賓改善APP/PS1小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的機(jī)制可能與促進(jìn)抗氧化應(yīng)激因子的表達(dá)，改善突觸結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)。