紫景天黃酮對大鼠實驗性牙周炎中iNOS的影響

姜 靜，王曉峰，邱麗娜，王 偉，張殿文，宋蓮蓮*,桑 雪*

(1.吉林省中日聯(lián)誼醫(yī)院 口腔科，吉林 長春130033；2.吉林省中醫(yī)藥科學院，吉林 長春130021)

牙周炎患者眾多，機制尚不明確，治療方法有限。誘導性一氧化氮合酶(iNOS)在牙周炎患者的牙齦組織中的表達明顯高于正常人，其表達強度與慢性牙周炎癥程度密切相關(guān)[1]。本研究采用免疫組化方法檢測紫景天黃酮對大鼠實驗性牙周炎牙周組織中iNOS表達的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 健康Wistar大鼠28只，購買于長春市億斯實驗動物技術(shù)有限責任公司，體重180-220 g，年齡6-8周，許可證號：SCXK(吉)-2016-0003。

1.1.2實驗藥劑 iNOS一抗(北京博奧森生物科技有限公司)，DAB染色試劑盒(武漢博士德生物科技有限公司)，多聚HRP二抗試劑盒(武漢博士德生物科技有限公司)，濃度1.0%紫景天黃酮(基質(zhì)為16%泊洛沙姆)由吉林省中醫(yī)藥科學院制劑室提供,脂多糖(LPS，吉林省中日聯(lián)誼醫(yī)院科學研究中心配制)。

1.1.3實驗器械 Leica RM2255型石蠟切片機(德國 Leica 公司)，Leica EG1140石蠟包埋機(德國Leica公司)，OlympusBX51光學顯微鏡(日本 Olympus 公司)，NIS-ELEMNT BR型圖像分析系統(tǒng)(日本NIKON公司)。

1.2 方法

1.2.1實驗性牙周炎模型的制備 28只健康Wistar大鼠，雌雄各半，隨機選取8只為正常組。余下20只為建模組大鼠，根據(jù)參考文獻[2,3]方法用帶牙齦卟啉單胞菌絲線結(jié)扎法建立大鼠實驗性牙周炎模型，并在牙周局部涂抹含1 mg/ml LPS的生理鹽水，15 μl/次,每 48 h涂抹 1 次,共 4 次。四周后檢查牙周情況，牙周指數(shù)為中重度牙周炎的改變，隨機處死2只，作病理觀察，鏡下牙周組織內(nèi)見大量炎細胞浸潤，微小膿腫形成；牙齦深層組織內(nèi)形成水腫與纖維組織增生，牙槽骨吸收，證明模型建立成功。

1.2.2藥物干預 將建模成功后的大鼠隨機分為模型對照組和紫景天黃酮治療組。在治療組和模型組大鼠牙周病患牙齦溝內(nèi)分別注入紫景天黃酮凝膠和基質(zhì)，0.5 ml/次/只，每日2次，次間隔為8 h，連續(xù)涂藥14天。正常組不做處理。

1.2.3牙周指數(shù)檢測 給藥前和給藥結(jié)束后分別檢查治療組和模型組大鼠的牙齦指數(shù)(GI)和齦溝出血指數(shù)(SBI)。檢測方法：用3%水合氯醛10 ml/kg腹腔注射麻醉大鼠，將其固定在木板上，用牙周探針沿牙周炎患牙的頰側(cè)齦緣輕輕滑動，按照國際通用標準記錄三組大鼠的GI和SBI。正常大鼠牙齦指數(shù)為0。

1.2.4病理組織取材 治療結(jié)束后，三組大鼠全部處死，取患牙牙周組織甲醛固定，梯度脫水、石蠟包埋切片。

1.2.5免疫組化染色 石蠟包埋切片經(jīng)二甲苯脫蠟和梯度乙醇脫水，室溫下用0.3%過氧化氫處理30 min。微波修復抗原5 min后，用非免疫性血清封閉，滴加iNOS抗體，4℃，過夜；然后二抗反應，室溫孵育2 h。以DAB為底物顯色后，蘇木精復染，常規(guī)樹脂封片。

1.2.6鏡下觀察 iNOS陽性信號表現(xiàn)為棕黃色或淺黃色，主要在牙周鱗狀上皮，疏松結(jié)締組織內(nèi)的血管內(nèi)細胞，成纖維細胞胞漿內(nèi)表達陽性信號。采用NIS-ELEMNT BR型圖像分析系統(tǒng)，分析iNOS表達的平均光密度值。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 牙齦指數(shù)和齦溝出血指數(shù)(見表1)

治療前模型組和治療組的GI和SBI均無顯著差異(P>0.05)，治療后紫景天黃酮治療組大鼠牙周指數(shù)均明顯低于模型組(P<0.001),且明顯低于給藥前(P<0.001)，模型組給藥前后牙周指數(shù)比較略有增高，但無明顯差異(P>0.05)。

表1 模型組和紫景天黃酮治療組牙齦指數(shù)和齦溝出血指數(shù)

注：與給藥前比較，#P<0.001,與模型組比較※P<0.001。

2.2 iNOS在三組中的表達

正常組內(nèi)牙齦上皮結(jié)構(gòu)完整，iNOS表達較少(圖1)，模型組內(nèi)牙齦上皮可見潰瘍與糜爛，炎性纖維成分中iNOS陽性信號高表達(圖2)，治療組牙齦組織內(nèi)炎細胞數(shù)量減少，iNOS表達減少(圖3)。 iNOS在三組中表達量的比較見圖4，治療組iNOS的表達量明顯低于模型對照組(P<0.01),模型對照組iNOS表達量明顯高于正常組(P<0.01)。

圖1 正常組(×200) 圖2 模型對照組(×200) 圖3 治療組(×200)

圖4 紫景天黃酮對實驗性牙周炎大鼠血清中iNOS的影響

3 討論

一氧化氮合酶(NOS)是機體合成一氧化氮(NO)最主要的限速酶[4],對NO在組織細胞中的含量有重要的調(diào)節(jié)作用，影響骨組織的修復，可間接反應機體的免疫及炎癥狀態(tài)[5]。有研究表明iNOS與炎癥的病理變化具有一定的相關(guān)性，有炎癥因子等刺激時大量表達，其高表達與牙周及牙髓炎癥具有相關(guān)性[6,7]。本研究大鼠實驗性牙周炎牙周組織免疫組化檢測結(jié)果表明，實驗性牙周炎大鼠牙周組織中iNOS的表達明顯高于正常大鼠的牙周組織，提示牙周炎局部的損傷、炎癥因子、細菌內(nèi)毒素等可能與iNOS的表達有一定的相關(guān)性。

紫景天為長白山野生藥材，其主要化學成分為多種黃酮類化合物。紫景天黃酮具有止血、減少毛細血管通透性、消腫止痛、促進潰瘍愈合、抑制牙周炎易感菌、增加大鼠自由基清除酶活性和降低自由基等功效[8，9]。

本研究紫景天黃酮提取物治療大鼠實驗性牙周炎，治療組治療后牙周指數(shù)明顯降低(P<0.001)，與模型組比較有顯著差異(P<0.001)，表明紫景天黃酮具有明顯減輕大鼠實驗性牙周炎癥的作用。

iNOS表達可能與牙周炎癥程度有一定的相關(guān)性[7]，本研究大鼠牙周組織切片免疫組化檢測顯示治療組牙周組織中iNOS的表達明顯低于模型組，紫景天黃酮可能通過抑制iNOS的生成或降低其活性，從而產(chǎn)生了抗炎作用。

本研究采用紫景天黃酮凝膠劑為純中藥制劑，使用方便，可以避免抗生素類藥物產(chǎn)生的弊端。牙周炎患者群眾多，是導致牙齒喪失的主要原因之一。紫景天藥源豐富，將其開發(fā)研制成治療牙周炎的中藥制劑，對牙周炎的防治具有重要的社會效益和經(jīng)濟效益。紫景天治療牙周炎的更多機理有待于進一步研究。