MiRNA210通過NUPR1基因靶向調控喉癌多藥耐藥性的研究

何 丹，王 蘋，李亞純，尹萬忠

(吉林大學第一醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科，吉林 長春130021)

miRNA是真核生物中一類長度約為22個核苷酸的參與基因轉錄后水平調控的非編碼小分子單鏈RNA，能通過與靶特異性的堿基配對引起靶mRNA的降解或抑制其翻譯，從而對基因進行轉錄后的表達調控[1,2]。miRNAs與腫瘤的多藥耐藥密切相關[3]，miRNA表達的改變可影響腫瘤細胞對化療藥物的敏感性。miRNA在腫瘤的多藥耐藥中與其作用的靶基因組成了一個復雜的網(wǎng)絡調控腫瘤的多藥耐藥性。本實驗擬研究miRNA210及其靶基因在喉癌多藥耐藥中的作用。

1 材料和方法

1.1實驗試劑RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清、Trizol試劑購于Invitrogen公司，miArrestTMmiRNA210 inhibitor Expression Clone慢病毒表達載體購自廣州復能基因公司。雙熒光素酶檢測試劑盒購自Promega公司。合成質粒HTRA1、NUPR1購自上海捷瑞公司。CCK8試劑盒購于碧云天生物技術研究所。

1.2方法

1.2.1構建熒光素酶報告基因載體驗證miRNA210的靶基因 合成我們前期研究中預測的miRNA210靶基因HTRA1、NUPR1 3’UTR序列，篩選并購買雙熒光素酶報告基因質粒pmirGLO，轉化、小量搖菌、小提質粒，將質粒郵寄上海捷瑞公司，將3’UTR序列插入到pmirGLO中。合成質粒HTRA1、NUPR1。購買miR210表達載體、 miR210抑制物載體，及相應的空載質粒對照，質粒提純并備用。報告基因質粒HTRA1、NUPR1與miR210表達質粒及對照共轉染293T細胞，轉染48小時后提取細胞裂解液并用于熒光素酶檢測，應用PROMEGA雙熒光素酶檢測試劑盒檢測螢火蟲及海腎熒光素酶活性。將NUPR1載體做定點突變，測序，比較突變后miRNA210能否抑制其表達。

1.2.2miRNA210抑制物質粒對喉癌多藥耐藥表型的改變 復蘇耐藥細胞Hep-2v。每50毫升含血清DMEM加入360 μl VCR儲存液(100 μM),miR210抑制物質粒轉染Hep-2v。CCK8 實驗:Hep-2v細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，分2組，轉染Control質粒組和轉染miR-210抑制物質粒組，每組設5復孔。在轉染后24 h點終止培養(yǎng)，每孔加入10 μl CCK8溶液，37℃下孵育1-4小時，測定450 nm處的OD值。細胞活力為處理組的OD值/正常組OD值×100%。

1.2.3轉染miRNA210抑制物質粒后多藥耐藥相關基因的表達 實驗分為三組，Hep-2v組，轉染對照組Control/Hep-2v組，轉染miRNA-210抑制物質粒組miR210in/Hep-2v組。Real-time RT-PCR檢測轉染抑制物前后MDR1、NUPR1基因的表達。以人Actin為內(nèi)參，PCR反應的特異性通過產(chǎn)物熔解曲線進行確認，mRNA的相對含量根據(jù)公式Fold change =2-ΔΔCT計算。CT為反應的實時熒光強度達到設定的閾值時所經(jīng)過的擴增循環(huán)數(shù)。

1.2.4轉染miRNA210抑制物質粒后多藥耐藥相關基因蛋白的表達 免疫熒光染色：細胞培養(yǎng)并收取樣本，棄去培養(yǎng)液，用PBS溶液洗滌2次，加入4%的多聚甲醛溶液固定30 min，用0.1 mol/L PBS洗滌3次，加入1% Triton X-100處理15 min，5%羊血清封閉1 h，加入一抗( Rabbit anti-Nupr1 ，1∶100稀釋，Rabbit anti-MDR1，1∶100稀釋)，4℃孵育過夜，用0.1 mol/L的PBS洗滌3×15 min，加入二抗(Alexa Fluor 555羊抗兔IgG，1∶400，Alexa Fluor 488羊抗兔IgG)，室溫避光放置1 h，0.1 mol/L的PBS洗滌，加入Hoechest33342標記細胞核，甘油封片，激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察。

1.3統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)來自至少3次獨立實驗，計量數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±標準差，用SPSS Statistics 10.0軟件進行分析,生長抑制的比較采用單因素方差分析，兩組比較采用t檢驗，P<0.05認為有統(tǒng)計學差異。

2 結果

2.1miRNA210靶基因的驗證

構建3′UTR報告基因質粒HTRA1、NUPR1分別與miRNA210表達質粒共轉染293T細胞，通過檢測報告基因/內(nèi)參基因的熒光比值確定miRNA210的作用靶點。結果見圖1。HTRA1的熒光值在miRNA210組和Control質粒組之間無明顯差別。而NUPR1質粒轉染的熒光值明顯低于轉染control質粒組。表明NUPR1基因可能是miRNA210的靶點。構建一個NUPR1 3′UTR的miRNA210靶點的突變質粒，與miRNA210共轉染，結果見圖2，野生型(WT)的NUPR1組的熒光值明顯低于突變組(MU)。進一步證實，NUPR1是miRNA210的作用靶點。

2.2抑制miRNA210表達對喉癌多藥耐藥表型的改變

轉染Control質粒組和轉染miRNA210抑制物質粒組(miR210in)通過 CCK8 實驗表明轉染miRNA210抑制物質粒組，Hep-2v細胞的存活率明顯降低。見圖3。

圖1 比較NUPR1和HTRA1質粒與miRNA210共表達的熒光值變化 圖2 比較野生型NUPR1和突變性NUPR1質粒與miRNA210共表達的熒光值變化 圖3 miRNA210抑制物質粒組對Hep-2v細胞的抑制作用miRNA210in/Hep-2v組與Control/Hep-2v組比較

2.3抑制miRNA210表達對喉癌多藥耐藥相關基因表達的改變

轉染miRNA210抑制物質粒組miR210in/Hep-2v組中NUPR1mRNA的表達明顯增高3.11倍，P<0.01,而MDR1mRNA的表達明顯降低2.05倍,P<0.01。表明抑制miRNA210的表達則喉癌耐藥細胞多藥耐藥基因的表達明顯逆轉。見圖4及圖5。

2.4抑制miRNA210表達對喉癌多藥耐藥相關基因蛋白表達的改變

P<0.01,miRNA210in/Hep-2v組與Control/Hep-2v組比較

P<0.01，miRNA210in/Hep-2v組與Control/Hep-2v組比較

Hep-2v細胞NUPR1蛋白(P8)表達位于細胞膜，少量位于細胞漿中，呈綠色熒光染色，miRNA210in/Hep-2v細胞組中NUPR1蛋白表達熒光強度明顯增加；而MDR1蛋白表達熒光強度明顯下降。見圖6及圖7。

圖6 miRNA210in轉染Hep-2v細胞NUPR1蛋白表達

圖7 miRNA210in轉染Hep-2v 細胞MDR1蛋白表達

3 討論

近年來，許多實驗室分別開發(fā)出了應用于預測miRNA靶基因的計算機方法，這些方法依據(jù)miRNA與靶基因3′UTR的序列互補性，包括miRNA5′端的稱之為“seed”或“nucleus”的串聯(lián)堿基的存在和該位點的物種間保守性，并計算了預測的miRNA：mRNA雙鏈的自由能。但是這種預測方法并不能完全確定miRNA的靶基因，需要通過實驗進一步驗證，而實驗驗證預測的靶基因常用的是構建熒光素酶報告基因載體。在這個載體的報告基因編碼區(qū)的下游含有靶基因的3′UTR區(qū)和推測的結合位點，用該載體轉染表達miRNA的細胞后，如果野生型載體中報告基因的活性低于帶有突變結合位點的載體中報告基因的活性，可證明這個miRNA確實作用于該靶基因[4]。

我們的前期實驗表明miRNA210與喉癌的多藥耐藥密切相關，我們通過Target數(shù)據(jù)庫預測出miRNA210的靶基因為HTRA1及NUPR1[5]。本實驗中我們通過雙熒光素酶報告基因載體實驗證實，NUPR1是miRNA210的作用靶點，即miRNA210可通過調控其靶基因NUPR1的表達影響喉癌的多藥耐藥性。

miRNAs與腫瘤的多藥耐藥密切相關，miRNA表達的改變可影響腫瘤細胞對化療藥物的敏感性，研究表明miR214同惡性腫瘤的多藥耐藥密切相關[6]，其調控機制與Wnt/β-catenin通路有關。Blower等[7]系統(tǒng)的研究了miRNA與腫瘤耐藥的關系并發(fā)現(xiàn)，miRNA表達譜和抗腫瘤藥物對腫瘤細胞的生長抑制作用密切相關。另外對頭頸部鱗癌細胞的研究發(fā)現(xiàn)抑制miR193a的表達能夠逆轉細胞的耐藥性。其機制是通過抑制p-73介導的反饋調節(jié)通路實現(xiàn)的[8]。也有研究表明miR212能夠調節(jié)類EGF肝素結合生長因子使頭頸部鱗癌細胞對西妥昔單抗產(chǎn)生耐藥性[9]。這些研究結果充分表明了miRNA在腫瘤的多藥耐藥中發(fā)揮著重要的作用，miRNA與其作用的靶基因組成了一個復雜的網(wǎng)絡調控腫瘤的多藥耐藥性[10]。

MiRNA不僅在特定的細胞層面影響腫瘤細胞的藥物耐藥，而且在藥物的作用方式上也發(fā)揮作用。例如，miR-34a表達水平的增高與耐多西紫杉醇的乳腺癌細胞系有關。然而與之相反miR-34a表達水平的下降將會增加尤文氏肉瘤細胞對阿霉素和長春新堿的敏感性[11]。在非小細胞肺癌中，miR-126可以有效的結合在血管內(nèi)皮生長因子(VEGFA)的3′非編碼區(qū)。而血管生成抑制劑貝伐單抗的作用靶點就在此區(qū)域。另外，miR-126的表達的升高可以逆轉腫瘤細胞的多藥耐藥性，這就為靶向治療提供可能性[12]。

miRNA210在低氧條件下能夠抑制細胞增殖。越來越多的研究表明低氧微環(huán)境是導致腫瘤臨床治療效果差的主要因素之一,它能夠增強腫瘤細胞對放化療的抵抗,同時也使其更易發(fā)生侵襲和轉移。多個miRNA參與了低氧反應過程,而miRNA210是低氧條件下反應變化最為顯著的miRNA之一[13]。miRNA210在頭頸腫瘤中的表達通常是升高的，miRNA210的表達可用來評定組織乏氧程度，同時也與頭頸癌患者的預后相關[14,15]。本組實驗中，我們構建了miRNA210抑制物質粒載體，并轉染到受體細胞中，結果表明抑制miRNA210的表達，喉癌細胞的存活率明顯降低，凋亡率明顯增高，喉癌多藥耐藥相關基因的mRNA表達及蛋白表達均有明顯改變，喉癌細胞的多藥耐藥性明顯逆轉。

研究結果表明miRNA210靶基因為NUPR1，抑制miRNA210的表達，可明顯增加喉癌細胞對化療的敏感性，miRNA210可通過調控其靶基因NUPR1的表達影響喉癌的多藥耐藥性。本研究可為以mRNA尤其是以miRNA210為靶點的藥物開發(fā)及逆轉耐藥治療提供依據(jù)，進而為提高喉癌化療的敏感性提供理論基礎，對喉癌的綜合治療有潛在的臨床應用價值。