SNPs及其在魚類遺傳育種中的應(yīng)用

謝嘉木

摘 要：SNPs分子標記是繼形態(tài)標記、細胞標記、生化標記之后發(fā)展起來的一種比較理想的一種DNA標記技術(shù)。本文簡要介紹SNPs分子標記的特點、基本原理，以及其在魚類遺傳圖譜構(gòu)建、性狀關(guān)聯(lián)分析等方面的應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：SNPs;魚類;遺傳圖譜;性狀關(guān)聯(lián)分析

中圖分類號：Q789 文獻標識碼：A 文章編號：1671-2064（2019）03-0203-02

1 SNPs概述

單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphism，SNPs）是指在基因組DNA序列中因單個堿基突變導致的多態(tài)性。常見的突變類型有單堿基轉(zhuǎn)換、顛換、插入及缺失。假設(shè)一種等位基因頻率在群體中不小于1%時，即可認定為SNP。在SNP的堿基突變類型中，轉(zhuǎn)換與顛換的頻率比為2：1，插入和缺失突變較少。并且轉(zhuǎn)換多以CT為主，出現(xiàn)這種突變的原因主要是甲基化大多發(fā)生在CpG島上的殘基C上，C殘基極易發(fā)生脫氨基化而轉(zhuǎn)變?yōu)門，因此CpG島自然而然成為了突變熱點。從理論水平上來講，SNPs應(yīng)該涉及到三種多態(tài)型：二、三和四等位基因多態(tài)性，但實際上后兩個是極其稀少的，因此SNPs也常被稱為二等位基因（或二態(tài)）遺傳標記。廣泛分布于基因組中的SNPs主要有兩種類型：第一類分布在基因的非編碼區(qū)，第二類分布在基因的編碼區(qū)（Coding SNPs，cSNPs）。第一類SNPs不會改變蛋白質(zhì)序列，也不會使個體呈現(xiàn)出突變的表型，卻又被廣泛應(yīng)用于群體的遺傳變異、物種進化等研究中。第二類cSNPs又可分為同義cSNPs和非同義cSNPs兩種類型。同義cSNPs產(chǎn)生的表現(xiàn)型與第一類分布在基因非編碼區(qū)的SNPs相似，而非同義cSNPs會對呈現(xiàn)出來的性狀產(chǎn)生影響，如：改變基因編碼的氨基酸序列，進而導致蛋白質(zhì)功能改變，最終改變其表現(xiàn)型，這種SNPs我們稱之為錯義cSNPs。此外，cSNPs會提前突變成終止密碼子，使得蛋白翻譯過程提前終止，進而影響蛋白的功能，呈現(xiàn)與原本不同的表現(xiàn)型，這種SNPs我們稱之為無義cSNPs。現(xiàn)有的實驗證據(jù)顯示，在使蛋白質(zhì)序列發(fā)生變化的cSNPs中，其中非同義cSNPs占20%左右。識別和鑒定一個種群內(nèi)所有個體間的SNPs及其差異性，將能有效獲得不同個體生長狀態(tài)、抗病力及對環(huán)境的適應(yīng)能力等相關(guān)信息，為魚類遺傳育種實踐提供理論參考，具有重要的實踐指導意義。

2 SNPs特點

SNPs特點主要有：（1）密度高。所有動植物的基因組中都廣泛存在大量的SNPs，如：在魚類中，平均每302bp長度的序列中就會出現(xiàn)一個SNP。（2）具備高的遺傳穩(wěn)定性。SNP的形成就是使單個核苷酸堿基發(fā)生改變，其突變頻率還是比較低的，因此，跟其它多態(tài)性分子標記（如：微衛(wèi)星）相比，其遺傳穩(wěn)定性就高。（3）代表性強。深入研究那些引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變的cSNPs，有助于我們解析某些疾病的發(fā)生機制和遺傳機理。（4）易于檢測自動化：由于SNPs為雙等位標記，只需采用“+/-”或“有或無”的分析方式，就可使得基于SNP的檢測方法易于實現(xiàn)自動化。

3 SNPs檢測方法

理論上，凡是能檢測點突變的技術(shù)都可用來檢測SNP標記。目前，研究者已開發(fā)出很多識別未知或已知SNP位點的方法，每種方法都有它的特點和缺點，在實際應(yīng)用時采用哪種方法要視研究者自身需求和條件而定。下面將介紹比較常見和經(jīng)典的檢測技術(shù)。

限制性酶切片段長度多態(tài)性（Restriction fragment length polymorphism，RFLP）：由于DNA限制性酶切所識別的核苷酸序列發(fā)生突變，會增加或減少酶切片段的數(shù)目，所產(chǎn)片段的大小也會發(fā)生變化，最終導致出現(xiàn)DNA多態(tài)的現(xiàn)象。具體過程：先用PCR技術(shù)擴增相應(yīng)片段，再用限制性內(nèi)切酶進行酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物即可檢測到變異的SNPs的變異。該方法優(yōu)點是簡便、快速，缺點是無法高通量檢測和發(fā)掘SNPs。

單鏈構(gòu)象多態(tài)性（Single-strand conformational polymorphism，SSCP）：是指由于單堿基突變而引發(fā)的小片段單鏈DNA三維構(gòu)象的變異而產(chǎn)生的多態(tài)性。流程是變性處理擴增獲得的DNA片段，使其形成單鏈。由于序列不同，單鏈構(gòu)象就有差異，在中性PAGE凝膠中電泳的遷移率就會不同，通過與標準物的對比，即可檢測出是否有SNPs。其優(yōu)點是方便、經(jīng)濟、檢測效率高（80%-90%以上）。

TaqMan探針法（TaqMan Probe）：通過帶有TaqMan 標記的PCR引物來擴增目的基因片段，再收集和檢測PCR過程中/后產(chǎn)生的熒光信號，從而獲得等位基因類型的SNPs，把這種技術(shù)稱之為TaqMan探針法。此方法優(yōu)點是無需對PCR產(chǎn)物進行處理，因此其檢測速度快;缺點是準確探針的設(shè)計。

基因芯片技術(shù)（Gene chip）：基因芯片的測序原理是在一塊基片表面固定了大量序列已知的靶核苷酸探針，通過雜交、測序獲得目標核酸序列，經(jīng)過信息處理鑒定出SNPs。該方法優(yōu)點是簡單、迅速、自動化的，但其其具有假陽性率高的缺點。

測序法（DNA sequencing）：直接測序是識別SNPs標記的最直接和最常用的方法。簡而言之，根據(jù)Sanger測序原理，利用測序儀來確定待測分子的DNA序列，通過比較分析進而獲得其SNPs位點信息。此方法優(yōu)點是準確性強，常用來驗證其他檢測方法的準確度。缺點是樣本檢測量少，耗時長，成本較高。

4 SNPs在魚類遺傳育種學中的應(yīng)用

4.1 高密度遺傳圖譜的構(gòu)建

遺傳圖譜是基因組學研究中重要的組成部分，是根據(jù)基因組中基因和專一的多態(tài)性標記之間的相對位置而繪制出來的圖譜，顯示所知的基因和/或遺傳標記的相對位置。遺傳圖譜在基因組結(jié)構(gòu)、功能、進化、質(zhì)量性狀和數(shù)量性狀基因鑒定等方面的研究中被廣泛應(yīng)用。由于SNP可反應(yīng)基因位點的多態(tài)性，因此可用它來構(gòu)建高密度遺傳圖譜。近年來，諸多學者在基于SNPs來構(gòu)建魚類遺傳圖譜的應(yīng)用研究中取得了較大程度的進展。如：王航俊[1]采用10個SSRs標記和11個SNPs標記對13個群體共367尾中華烏塘鱧進行群體遺傳學分析，這些SSRs標記和SNPs標記為不同類群的分類提供了有效的工具。鄭先虎[2]基于高分辨率的SNPs標記成功構(gòu)建了鯉的整合圖譜，并與斑馬魚基因組的圖譜進行比較分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：鯉與斑馬魚之間存在大量保守區(qū)域。

4.2 性狀關(guān)聯(lián)分析

在常規(guī)育種的基礎(chǔ)上，借助分子標記對目標性狀進行選擇，通過分析不同基因型與生長性狀進行相關(guān)性分析等，可大大減少育種的盲目性。王倩[3]等人分析谷胱甘肽硫-轉(zhuǎn)移酶M基因與魚類低溫耐受性的相關(guān)性時，運用PCR-SSCP 技術(shù)研究了130尾斑馬魚GSTM 基因5-UTR、3-UTR和第一內(nèi)含子序列的SNP，同時分析了篩選到的基因型與其低溫耐受性狀的關(guān)聯(lián)性。研究結(jié)果表明GSTM基因SNPs位點與斑馬魚低溫耐受性能關(guān)聯(lián)分析提供了依據(jù)，也將為海水經(jīng)濟魚類抗寒標記篩選育種提供參考。王桂興[4]等人以雌核發(fā)育牙鲆（Paralichthys olivaceus）為對象，根據(jù)GenBank收錄的牙鲆生長激素基因序列設(shè)計9對引物，采用直接測序法對50尾雌核發(fā)育牙鲆生長激素基因編碼區(qū)和啟動子進行了SNPs篩選，共檢測到7個SNPs。經(jīng)SNPs與生長性狀關(guān)聯(lián)分析后，結(jié)果表明：只有兩個SNPs位點（C477T和2067T/-del）與牙鲆的體重、體長、體高等生長性狀明顯相關(guān)（P<0.05），而其他5個SNPs位點不存在生長性狀相關(guān)性（P>0.05）。該結(jié)果將為牙鲆生長性狀的SNPs標記輔助選育提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和理論參考。

參考文獻

[1] 王航俊.基于SSR和SNP標記研究我國沿海中華烏塘鱧的種群遺傳結(jié)構(gòu)[D].廈門大學，2012.

[2] 鄭先虎.鯉連鎖圖譜及生長、肉質(zhì)性狀QTL定位研究[D].上海海洋大學，2012.

[3] 王倩，尤鋒，辛夢嬌，等.斑馬魚GSTM單核苷酸多態(tài)性與低溫耐受性的相關(guān)分析[J].海洋科學，2015，39（1）：1-7.

[4] 王桂興，等.牙鲆GH基因的SNPs與生長性狀關(guān)系的初步研究[J].中國水產(chǎn)科學，2015，22（2）：347-352.