井岡霉素產(chǎn)生菌的誘變選育及發(fā)酵條件優(yōu)化

陸佳斌 王銀泉

摘 要：此次研究主要通過可以吸水的一種鏈霉菌井崗變種作為研究對象，通過硫酸二乙酯以及紫外線進(jìn)行誘變，并通過平皿進(jìn)行初步篩選，通過搖瓶進(jìn)行復(fù)篩，從而獲得高效價菌株，且通過實(shí)驗(yàn)研究，此菌株的遺傳性較為穩(wěn)定，同時通過正交實(shí)驗(yàn)以及單因素實(shí)驗(yàn)對最佳發(fā)酵培育基以及發(fā)酵條件進(jìn)行研究和分析。

關(guān)鍵詞：井岡霉素;產(chǎn)生菌;誘變選育;發(fā)酵條件

中圖分類號：Q933

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

農(nóng)用抗生素是農(nóng)業(yè)常見的應(yīng)用藥品之一，其主要是由微生物形成的一種次級代謝物，能夠?qū)r(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中出現(xiàn)的有害生物進(jìn)行有效的防治，從農(nóng)用抗生素的作用功能方面進(jìn)行劃分，可分為殺蟲抗生素、防病抗生素以及除草抗生素，隨著我國對這一類藥物的研究不斷深入，目前，已經(jīng)出現(xiàn)了井岡霉素、武夷霉素、農(nóng)抗120、瀏陽霉素等一系列農(nóng)用抗生素。此次研究的井岡霉素主要是在井岡山發(fā)現(xiàn)的微生物菌株所形成的一種農(nóng)用抗生素，主要用于水稻紋枯病、稻瘟病等，由于其具有低毒、高效以及對環(huán)境污染小等優(yōu)點(diǎn)，因此，被人們廣泛應(yīng)用。然而，此類農(nóng)用抗生素的生產(chǎn)水平方面仍不高，此問題已經(jīng)成為當(dāng)前眾多研究人員研究的重點(diǎn)課題，在研究的過程中，高產(chǎn)菌株的選育便是其中的一有效的方法，并且通過發(fā)酵培養(yǎng)基及優(yōu)化培養(yǎng)條件也能夠提高其生產(chǎn)水平，本文將對這兩方面做出實(shí)驗(yàn)研究。

1?實(shí)驗(yàn)材料

1.1?菌種的選擇

本次實(shí)驗(yàn)所選取的菌種為吸水鏈霉菌井岡變種、水稻紋枯病菌。

1.2?培養(yǎng)基

試管斜面以及孢子活化：高氏Ⅰ號培養(yǎng)基。

發(fā)酵培養(yǎng)基：黃豆餅粉3.0%、米粉9.0%、NaCl0.15%、KH2PO40.1%，pH為6.7。

2?實(shí)驗(yàn)方法

2.1?誘變選育法

在誘變操作之前應(yīng)該對單孢子懸液進(jìn)行制備，并調(diào)整孢子的濃度，濃度為108個/mL。

紫外線誘變：取出制備完成的單孢子懸液，將其置入培養(yǎng)皿之中，并將其放置在攪拌器上面，對培養(yǎng)皿與紫外線燈之間的距離進(jìn)行調(diào)整，距離為30cm，然后將培養(yǎng)皿的皿蓋打開，然后使用攪拌器進(jìn)行恒速攪拌，同時使用紫外線燈對其進(jìn)行照射，照射時間選段分別為0、30、60、90、120、150、180s，當(dāng)照射完畢之后，對孢子懸液進(jìn)行梯度稀釋，然后進(jìn)行涂板培養(yǎng)，培養(yǎng)的過程中應(yīng)該遮蔽光線。

硫酸二乙酯誘變：在紫外線誘變所形成的正變菌株之中選取菌株，保證菌株的效價具備較高的水平，通過此菌株進(jìn)行硫酸二乙酯誘變，取出最新已制備完畢的出發(fā)菌株所形成的孢子懸液，劑量為5mL，將其置入到0.04mL的硫酸二乙酯之中，然后再向其中加入磷酸緩沖液，緩沖液的濃度為0.1mol/L，pH為7.0，劑量為15ml，并將其放置在搖床上，搖床的溫度為37℃，頻率為200r/min，然后分別處理0.2、0.5、1.5、6h，處理完畢之后將濃度為2%的Na2SO3加入其中，然后結(jié)束誘變，最后將處理完畢的孢子懸液進(jìn)行梯度稀釋，并將其涂板培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中仍需要注意避光進(jìn)行。

2.2?測定效價

測定效價（初篩）：將水稻紋枯病菌作為檢定菌。

測定效價（復(fù)篩）：測定需要執(zhí)行《井崗霉素水劑國家標(biāo)準(zhǔn)》（GB/T9553-93），并通過液相色譜法對其效價進(jìn)行測定。

2.3?效價計(jì)算方法

對井崗霉素的效價進(jìn)行計(jì)算的過程中，仍需要執(zhí)行《井崗霉素水劑國家標(biāo)準(zhǔn)》（GB/T9553-93），并通過液相色譜法對井崗霉素A進(jìn)行測定，并對試樣進(jìn)行500倍的稀釋，同時通過ODS-C18色譜柱以及紫外線檢測器分離井崗霉素，并對峰面積應(yīng)用外標(biāo)法進(jìn)行定量，從而使井崗霉素的效價得以算出。

2.4?遺傳穩(wěn)定性檢測實(shí)驗(yàn)

將通過誘變操作之后形成的高產(chǎn)菌株置于斜面之上，并進(jìn)行5次的連續(xù)傳代，并對其代間效價進(jìn)行檢測。

3?結(jié)果

3.1?菌株誘變選育的結(jié)果

3.1.1?紫外線誘變結(jié)果

通過對出發(fā)菌株采取紫外線誘變之后，如表1所示，當(dāng)誘變的時間逐漸增加時，菌株出現(xiàn)的致死率會不斷的上升，因此，應(yīng)該選擇在最短的時間之內(nèi)對菌株進(jìn)行誘變選育處理，當(dāng)完成紫外線誘變之后，通過平板初篩后，出現(xiàn)正變菌株共計(jì)73株，然后采取搖瓶發(fā)酵的方法進(jìn)行復(fù)篩，通過對效價進(jìn)行檢測，共計(jì)檢測出3株較高效價的菌株，然后進(jìn)行硫酸二乙酯誘變。

3.1.2?硫酸二乙酯誘變

如表2所示，硫酸二乙酯能夠使菌株很容易致死，通過使用硫酸二乙酯進(jìn)行為時0.2h的處理之后，菌株的致死率能夠達(dá)到92.6%，但隨著時間的增加，致死率雖也在增加，但增加的幅度卻極大的降低，而經(jīng)過上述的30s內(nèi)對菌株進(jìn)行紫外線誘變處理之后，在通過硫酸二乙酯進(jìn)行誘變處理，從而通過選育能夠形成高產(chǎn)菌株，通過效價計(jì)算為25878×10-6g/mL。同時，通過穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明其遺傳穩(wěn)定性較為良好。

3.2?發(fā)酵條件的優(yōu)化

3.2.1?各類碳源、氮源對井岡霉素能力產(chǎn)生的影響

本次研究主要選取6種碳源對發(fā)酵培養(yǎng)基之中的碳源進(jìn)行了替代，這6種碳源分別為碳酸鈣、牛肉膏、碳酸氫鈉、淀粉、葡萄糖、乳糖，通過實(shí)驗(yàn)可知，淀粉效價可達(dá)到28089×10-6g/mL，屬于6種碳源之中最高的一種碳源（培養(yǎng)基碳源米粉為25869×10-6g/mL）。

同樣，此次研究也選取了6種氮源對發(fā)酵培養(yǎng)基之中的氮源進(jìn)行替代，這6種氮源分別為酵母粉、蛋白陳、蠶蛹粉、硝酸鉀、氯化銨以及硝酸銨，其中。酵母粉的效價可達(dá)到27.68×10-6g/mL，屬于6種氮源之中最高的一種氮源（培養(yǎng)基氮源黃豆餅粉為25863×10-6g/mL）。

3.2.2?培養(yǎng)基初始的pH對井岡霉素能力產(chǎn)生的影響

為使各初始pH對井岡霉素能力產(chǎn)生的影響進(jìn)行對比，通過不相同的pH形成的緩沖溶液用于發(fā)酵培養(yǎng)基的配制，通過研究可知，當(dāng)pH=7.2時，菌株具備最強(qiáng)的產(chǎn)素能力，pH值或高或低都不能夠使菌株的產(chǎn)素能力提升，故對pH7.2作為培養(yǎng)基初始的pH。

3.2.3?培養(yǎng)溫度對井岡霉素能力產(chǎn)生的影響

當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基完成接種之后，將其各置入到溫度為33℃、35℃、37℃、39℃以及41℃的培養(yǎng)溫度環(huán)境之中，然后進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，通過培養(yǎng)結(jié)果可知，當(dāng)培養(yǎng)溫度為37℃的情況下，井岡霉素能力便能夠達(dá)到最強(qiáng)狀態(tài)。

3.2.4?接種量以及種齡對井岡霉素能力產(chǎn)生的影響

取種齡不同的液體種子參與實(shí)驗(yàn)，種齡可劃分為60h、72h、84h、96h，通過研究，結(jié)果表明種齡與井岡霉素能力之間是正相關(guān)的關(guān)系，同時，將96h種齡的液體種子以8%、10%、12%、14%的接種量用于發(fā)酵培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，接種量為8%的情況下，井岡霉素的能力最強(qiáng)。

3.2.5?正交試驗(yàn)

正交試驗(yàn)依據(jù)為L9（34）表，主要對酵母粉、淀粉、NaCl以及KH2PO4這4個因素進(jìn)行正交試驗(yàn)。通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得知其最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為：酵母粉4%、淀粉12%、NaCl為0.15%、KH2PO4為0.05%，其化學(xué)效價可以達(dá)到29443×10-6g/mL，以極差作為依據(jù)進(jìn)行分析可知，淀粉對井岡霉素，其次具備較大影響的是酵母粉，而NaCl以及KH2PO4對產(chǎn)素方面的能力具有較小的影響。

4?討論

隨著近年來生物學(xué)不斷的發(fā)展，菌種選育的方法出現(xiàn)了創(chuàng)新，但通過誘變育種這種方法，能夠有效的使產(chǎn)素能力得以提升，本文主要通過紫外線誘變以及硫酸二乙酯誘變對菌株進(jìn)行誘變，通過2次誘變，能夠?qū)⒕晷r提升至25878×10-6g/mL，此效價要比出發(fā)菌株高很多，并且在遺傳穩(wěn)定性方面表現(xiàn)的較為良好。與此同時，在進(jìn)行液相色譜實(shí)驗(yàn)的過程中，對以往通過稀釋法進(jìn)行測定過程中產(chǎn)生的誤差大、不易掌握、測時較長等缺陷進(jìn)行了克服，從而提升產(chǎn)菌的能力。

在誘變選育的前提下，通過培養(yǎng)條件發(fā)熱優(yōu)化、培養(yǎng)基配方以及正交試驗(yàn)的實(shí)施，能夠得出最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為：酵母粉4%、淀粉12%、NaCl為0.15%、KH2PO4為0.05%，其化學(xué)效價可以達(dá)到29443×10-6g/mL。從而為井岡霉素的工業(yè)生產(chǎn)創(chuàng)造了基礎(chǔ)。

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作者簡介：

陸佳斌（1990- ），男，浙江省海寧市人，本科，研究方向：輕化工程;

王銀泉（1962- ），男，浙江省海寧市人，本科，研究方向：生物農(nóng)藥。