幾種因素優(yōu)化對(duì)林木組織培養(yǎng)增殖培養(yǎng)影響探討

焦磊，史紹林

(1.黑龍江省林業(yè)監(jiān)測規(guī)劃院，黑龍江 哈爾濱 150008；2.黑龍江省森林與環(huán)境科學(xué)研究院，黑龍江 齊齊哈爾 161005)

組培工廠化育苗是個(gè)系統(tǒng)工程[1]，繼代增殖技術(shù)是組培技術(shù)的核心，培養(yǎng)時(shí)間、增殖周期、增殖倍數(shù)、增殖系數(shù)、玻璃化等指標(biāo)直接決定了組培產(chǎn)業(yè)化育苗的成本，是組培需優(yōu)先解決的關(guān)鍵技術(shù)問題，尤其是試管苗繼代過程中的芽增殖率是一個(gè)重要經(jīng)濟(jì)指標(biāo)。雖然很多文獻(xiàn)都探討了如何建立初步的組織培養(yǎng)體系，但普遍增殖倍數(shù)較低，玻璃化率高、增殖周期長等條件限制了組培技術(shù)發(fā)展，不能滿足工廠化育苗的要求。筆者根據(jù)實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，探討了增殖培養(yǎng)過程中基本培養(yǎng)基的不斷優(yōu)化，增殖周期的優(yōu)化及玻璃化的控制對(duì)增殖優(yōu)化的影響。

1 增殖基本培養(yǎng)基優(yōu)化

增殖培養(yǎng)中培養(yǎng)基是植物組織培養(yǎng)最重要的部分[2]，在增殖組織培養(yǎng)過程中，不同植物或者不同類植物的培養(yǎng)基不一定相同，有時(shí)同種植物不同部分或者同個(gè)生長階段對(duì)培養(yǎng)基的營養(yǎng)要求也有所差異。經(jīng)過科研人員不斷探索改進(jìn)，現(xiàn)應(yīng)用于植物組織培養(yǎng)中的培養(yǎng)基約幾十種。目前，培養(yǎng)基的配方基本上是以MS配方為基礎(chǔ)，加入一些活性物質(zhì)改進(jìn)的。培養(yǎng)基的成分主要包括無機(jī)鹽類的大量元素及微量元素和有機(jī)物質(zhì)，碳源主要是蔗糖，有機(jī)養(yǎng)料一般用水解酪蛋白、氨基酸等。隨著培養(yǎng)基配方的逐步改良，加入了維生素和其他活性物質(zhì)。試驗(yàn)過程中，為調(diào)控變量，采用了較高純度的藥品和重蒸餾水。大量生產(chǎn)應(yīng)用時(shí)，為降低成本可以用自來水代替重蒸餾水、普通蔗糖代替分析純蔗糖、采用馬鈴薯培養(yǎng)基等，同樣可以取得很好的效果。為了實(shí)現(xiàn)利用組織培養(yǎng)技術(shù)對(duì)文心蘭種苗工廠化生產(chǎn)，何松林[3]、谷風(fēng)等[4]均開展了基本培養(yǎng)基增殖優(yōu)化，通過對(duì)不同基本培養(yǎng)基對(duì)比，認(rèn)為1/2MS的基本培養(yǎng)基對(duì)增殖最佳。葉秀仙等[5]通過正交試驗(yàn)，篩選出適合于文心蘭 ‘小櫻桃’叢生芽增殖的基本培養(yǎng)基為改良1號(hào)，認(rèn)為對(duì)特定基因型材料進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，必須考慮材料的基因型，并且認(rèn)為可能特定的基因型需要的大量元素不同。馬雪筠等[6]在篩選香蕉增殖培養(yǎng)的理想途徑培養(yǎng)過程中認(rèn)為，在植物生長調(diào)節(jié)劑方面， 6-BA 3～5 mg·L-1具有較為理想的增殖率；而夏晶暉等[7]的試驗(yàn)則指出，6-BA 0.5～1 mg·L-1是最好的分化增殖培養(yǎng)配方。刁桂萍在對(duì)歐美雜種優(yōu)良無性系進(jìn)行組培繁育技術(shù)的研究，發(fā)現(xiàn)能夠誘導(dǎo)歐美山楊雜種快繁的最適培養(yǎng)基是NT + BA 0.1 mg·L-1+ KT0.5 mg·L-1+2%蔗糖，同時(shí)利用再生試管苗的幼化特性，結(jié)合試管外生根技術(shù)、扦插技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)優(yōu)良材料的大量繁殖，為歐美山楊雜種生產(chǎn)走上工廠化、產(chǎn)業(yè)化之路提供科學(xué)的技術(shù)依據(jù)[8]。楊林星用美國紅楓自由人槭‘秋焰’當(dāng)年生枝莖段和休芽為外植體，得出其最佳消毒方式為0.1% HgCl2處理80 s，成活率可達(dá)80%，最適的增殖培養(yǎng)基為：改良MS培養(yǎng)基+IBA0.05 mg·L-1+ZT0.1 mg·L-1[9]。隨著數(shù)學(xué)、統(tǒng)計(jì)學(xué)在組織培養(yǎng)中的充分應(yīng)用，為了達(dá)到不定芽增殖的極大值，正交設(shè)計(jì)、均勻設(shè)計(jì)、回歸設(shè)計(jì)、二次回歸正交旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)等方法被充分應(yīng)用到增殖培養(yǎng)篩選培養(yǎng)基中[10，11]，力求達(dá)到組培工廠化育苗的要求。尤其是二次回歸正交旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)將回歸分析法與正交試驗(yàn)法的優(yōu)點(diǎn)有機(jī)地結(jié)合起來，在多種多因素、單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行擬合，建立回歸模型，并對(duì)其進(jìn)行模擬尋優(yōu)，從中推導(dǎo)、篩選出最佳的措施和策略。

2 增殖周期的優(yōu)化

增殖培養(yǎng)是組織培養(yǎng)的核心技術(shù)，是組織培養(yǎng)區(qū)別于扦插、嫁接、埋干等無性繁殖的最大優(yōu)越性的體現(xiàn)。增殖培養(yǎng)過程中，不同濃度的細(xì)胞分裂素與生長素不斷的刺激外植體，使得不定芽等在離體條件下長期使用植物激素，生長點(diǎn)分生組織一直處于不斷分化的活躍狀態(tài)，隨著繼代次數(shù)的增加，研究人員一方面擔(dān)心實(shí)驗(yàn)材料是否會(huì)保持原來的再生能力和增殖率[12]；另一方面也有研究表明隨著繼代次數(shù)的增多和時(shí)間的延長，染色體有可能會(huì)發(fā)生變異，導(dǎo)致增殖潛力降低[13]。蒲秀琴[14]等通過對(duì)百合組培苗數(shù)次繼代培養(yǎng)， 發(fā)現(xiàn)開始隨著繼代次數(shù)的增加，不定芽的增值率不斷提高，繼代培養(yǎng)三次時(shí)每個(gè)芽可增殖6個(gè)左右， 分化率較高， 同時(shí)組培苗的長勢最好， 之后隨著繼代次數(shù)的增加，分化率則逐漸下降。在木本植物中，隨著繼代次數(shù)的增加，增殖率不斷增加并穩(wěn)定的研究較多，例如曹孜義在研究葡萄離體培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，葡萄繼代增殖 48～80 代后增殖倍數(shù)并未降低[15]，師校欣等[16]研究發(fā)現(xiàn)蘋果離體培養(yǎng)100 余次，其器官再生能力沒有顯著變化。增殖周期的確定也是組培過程中的重要環(huán)節(jié)。周期過短，新芽形成的數(shù)量和質(zhì)量會(huì)對(duì)下一步試驗(yàn)造成影響；周期過長，不僅浪費(fèi)增殖時(shí)間，還會(huì)對(duì)形成的新芽造成影響。筆者曾在自由人槭的研究中將自由人槭不定芽處理后接入培養(yǎng)基中，經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)7 d后有新葉形成，14 d左右有新芽形成于莖段腋芽處，15 d左右新芽大量冒出，但長勢較弱，28 d后有效芽趨于穩(wěn)定，到35 d后芽的生長趨勢開始下降，狹小的培養(yǎng)瓶和固定培養(yǎng)基已經(jīng)不利于生長。為了提高增殖效率、縮短增殖時(shí)間，筆者認(rèn)為28 d的增殖周期比較適宜。

3 增殖培養(yǎng)過程中玻璃化的控制

玻璃化是非受傷脅迫條件下試管苗的一種生理病變。隨著增殖培養(yǎng)時(shí)間、次數(shù)的增加，玻璃化現(xiàn)象是不可避免的。玻璃化發(fā)生時(shí)，葉片表面缺少蠟質(zhì)和角質(zhì)層，組織畸形，很難恢復(fù)到原來的狀態(tài)。自從玻璃化的概念提出后，玻璃化現(xiàn)象已經(jīng)至少在3種木本植物中發(fā)生，玻璃化帶來的問題也越來越受到人們重視。關(guān)于玻璃化的控制和發(fā)生機(jī)理一直有各種假設(shè)和證實(shí)。玻璃化的本質(zhì)是維管束木質(zhì)化低，細(xì)胞含水量高。因此在組培工廠化生產(chǎn)中主要從降低含水量的方向入手。研究者在研究甜柿的組培體系時(shí)發(fā)現(xiàn)，水分狀況不佳是玻璃化的根本原因，將瓊脂濃度提高到10 g·L-1可降低培養(yǎng)基的水勢，能有效地防止玻璃苗的發(fā)生[17]。當(dāng)三角瓶和培養(yǎng)皿中空氣不流通，氧氣不足的時(shí)候，也可能會(huì)因水量較高導(dǎo)致玻璃化。科學(xué)工作者為了解決培養(yǎng)瓶內(nèi)水量較高的問題，還采用在制作完培養(yǎng)基之后，放置一段時(shí)間，讓水分充分蒸發(fā)。同樣的道理，也有人用透氣性好的牛皮紙或者棉塞封口，但這有可能會(huì)增加勞動(dòng)強(qiáng)度，增加不必要的工作量，從而增加成本。此外減少培養(yǎng)瓶內(nèi)接種數(shù)量，適當(dāng)增加光照，或者增加某些陽離子的濃度，都可降低水勢，從而在一定程度上減少玻璃化的發(fā)生。