氧化應激與自噬在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中的研究進展

薛萬華，楊 婷

德州市人民醫(yī)院檢驗科，山東 德州 253000

動脈粥樣硬化（AS）是一種主要累及大、中型動脈，以粥樣斑塊形成為特征的慢性病變，它的發(fā)生涉及多因素和多環(huán)節(jié)的調控紊亂，如血管平滑肌細胞、炎癥細胞、內皮細胞、巨噬細胞等的功能失調，是遺傳因素和環(huán)境共同作用的結果[1]。對于AS的發(fā)生機制，目前形成了多種學說，氧化應激學說是其重要組成部分。同時，研究人員發(fā)現(xiàn)自噬這一廣泛存在于機體各種病理生理過程的中現(xiàn)象在AS的發(fā)生發(fā)展過程中也發(fā)揮重要作用。但兩者在AS過程中發(fā)揮作用的具體機制，以及二者間的相互調節(jié)機制至今仍不十分清楚，本文將對近年來氧化應激與自噬及其相互作用在AS發(fā)生發(fā)展過程中的研究進展作一綜述。

1 NADPH氧化酶是AS的主要氧化應激壓力

氧化應激是指機體在正常代謝或受到各種有害刺激時，產生活性氧自由基（ROS）和活性氮自由基（RNS）等高活性分子，當這些高活性分子產生的速度超過清除速度，會導致體內氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，造成組織損傷。氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）的生成被認為是動脈粥樣硬化的早期關鍵事件，研究證明氧化應激在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程中起著十分重要的作用，尤其是對于低密度脂蛋白的氧化修飾作用，即ox-LDL的生成。NADPH氧化酶（Nox）氧化應激反應過程中ROS的主要來源[1]，Nox是一類廣泛表達于各種動物血管組織細胞中的酶，由其產生的ROS涉及包括有絲分裂、細胞凋亡、遷移、增生和細胞外基質的調節(jié)修飾在內的多個病理生理過程。最初對它的研究是在免疫系統(tǒng)的專職性吞噬細胞中，近來研究發(fā)現(xiàn)其在血管內皮細胞、平滑肌細胞、心肌細胞等非吞噬性細胞中也廣泛表達。在高糖、高脂、促有絲分裂或轉化生長因子等的刺激下，Nox表達上調導致ROS的產生增加[2]。Nox的作用是將電子從NADPH傳遞給超氧陰離子自由基（O2·-），該自由基不能穩(wěn)定存在且不能跨膜，之后在超氧化物歧化酶的催化下O2·-轉化為較穩(wěn)定并可以跨膜擴散的H2O2，參與調節(jié)細胞信號通路，調控細胞病理生理過程[3]。已發(fā)現(xiàn)人體內存在的Nox亞型共7種，存在于脈管系統(tǒng)的有4種，分別是Nox1/2/4/5。有學者認為，Nox1，2和5來源的過氧化物，引起血管壁內皮細胞功能失調，炎癥反應和細胞凋亡，Nox4產生H2O2，增加NO生物利用度，對血管壁起保護作用[4]。

目前對Nox在動脈粥樣硬化中作用的研究多以ApoE-/-小鼠為研究對象，該小鼠模型膽固醇代謝異常，其主動脈及分支處可自發(fā)形成動脈粥樣硬化斑塊。過表達NOX的轉基因小鼠與野生型小鼠相比頸動脈AS損傷程度更明顯，而采用NOX抑制劑GKT137831后，AS斑塊處的炎癥反應明顯降低，斑塊面積明顯減小[5]。Nox1是目前研究最多的Nox，Sobey等[6]發(fā)現(xiàn)ApoE-/-小鼠高脂飲食喂養(yǎng)14周后，Nox1表達顯著下降，Nox1（-/y）/ApoE（-/-）雙基因敲除小鼠體內出現(xiàn)較高的VLDL/LDL和甘油三酯，且與ApoE（-/-）單基因敲除的小鼠相比，雙基因敲除小鼠主動脈竇處內膜厚度增加了40%，該處斑塊所含膠原減少了60%，平滑肌減少了40%，基質金屬蛋白酶-9則增加了2.5倍，表明Nox1在ApoE-/-小鼠中對高脂血癥和動脈粥樣硬化起保護作用。Gray等[7]發(fā)現(xiàn)用藥物抑制Nox1和Nox4的表達后，能顯著抑制糖尿病小鼠動脈粥樣硬化進程。通過基因敲除Nox1或Nox2均可通過影響體內NO生物活性來調節(jié)動脈血管舒張[3]。Nox2在動脈粥樣硬化斑塊處的表達顯著上調，Nox2抑制劑能延緩動脈粥樣硬化進程[8]，可以作為治療動脈粥樣硬化的潛在靶標，夾竹桃麻素（Apocynin）是NOX1/2的拮抗劑，該領域是心血管疾病新的治療方法。Nox4在人體內含量最為豐富，研究發(fā)現(xiàn)內皮細胞中表達的Nox4調節(jié)內皮細胞活化，功能失調及損傷，促進動脈粥樣硬化的發(fā)展、高血壓、心肌肥大等其他心血管系統(tǒng)疾病。Nox也可通過調節(jié)靶基因的表達，影響細胞功能，在動脈粥樣硬化發(fā)展過程中起重要作用[3]。Nox4來源的ROS在AS過程中主要起保護作用，在小鼠血管平滑肌細胞中增加Nox4的表達活性，將增加TGFβ1水平，通過促進炎癥反應加速動脈粥樣硬化進程[9]。Nox4來源的H2O2通過影響內皮型一氧化氮合酶（eNOS）活性來舒張血管，動物實驗結果表明敲除Nox4基因會引起內皮細胞功能失調，加速動脈粥樣硬化過程[10]。Nox4-/-小鼠動脈粥樣硬化程度明顯加重，H2O2生成減少導致炎癥因子IL-1β，TNF-α及血管巨噬細胞堆積的減少。同時Gray等[11]發(fā)現(xiàn)，Nox2的表達與Nox4呈負相關，這為研究Nox2活性調控Nox4某些作用的缺失提供了可能。在粥樣硬化斑塊處的平滑肌細胞中研究人員觀察到Nox5的表達增加[12]，直接活化eNOS，產生過氧亞硝基陰離子，導致內皮細胞功能損傷。

2 自噬在AS進程中的雙重作用

自噬是細胞將錯誤折疊的蛋白質或受損細胞器包裹形成自噬體，再與溶酶體結合降解，從而維持細胞內環(huán)境穩(wěn)態(tài)的過程。按照生理功能和進入溶酶體方式的不同，自噬分為3種類型：巨自噬、微自噬和分子伴侶介導的自噬，其中巨自噬是目前獲得關注最多的一類，它廣泛存在于機體各種病理生理過程中，如感染、腫瘤、神經系統(tǒng)疾病、心血管疾病等[13]，而其具體作用機制仍有待進一步研究。通常自噬被認為是細胞的一種自我保護機制，但近來研究發(fā)現(xiàn)，自噬與細胞死亡，即細胞自噬性死亡，也存在著密切聯(lián)系，研究發(fā)現(xiàn)自噬在動脈粥樣硬化過程中似乎存在著保護和損害的雙重作用[14]。

在動脈粥樣硬化進程中，自噬在保護細胞對抗氧化應激，減少細胞凋亡和增加AS斑塊的穩(wěn)定性方面發(fā)揮重要作用。當血管平滑肌細胞受到oxLDL、氧化應激等刺激時，自噬過程的關鍵蛋白LC3、beclin1表達增加，自噬過程啟動，清除細胞內受損結構，維持細胞內環(huán)境穩(wěn)態(tài)[15]。脂滴是巨噬細胞源性泡沫細胞內膽固醇的主要貯存場所，通過自噬，脂滴與溶酶體結合，溶酶體酸性脂肪酶水解膽固醇酯產生游離膽固醇，經由ATP結合盒轉運蛋白A1（ABCA1）轉運出細胞，即膽固醇的逆向轉運。

在內皮細胞中，自噬能抑制巨噬細胞凋亡，減少胞葬作用，當在LDLR-/-小鼠模型中自噬過程被抑制時，早期動脈粥樣硬化斑塊壞死和氧化應激造成的損傷加重[16]。7-酮基膽固醇（7-KC）可促進細胞氧化應激、內質網壓力、細胞凋亡，當其刺激巨噬細胞6 h后，在細胞內觀察到產生了大量自噬體[16]。7-KC作用于平滑肌細胞能增加相關蛋白泛素化，顯著抑制由低濃度他汀類藥物引起的細胞死亡[17]。過量的ox-LDL產生氧化應激產物會增加清道夫受體LOX-1的表達，從而減少保護性自噬反應，進而引進內皮細胞功能失調這一動脈粥樣硬化早期關鍵事件的發(fā)生，加速動脈粥樣硬化進程[18]。增加AMPK α1的表達可上調FoxO3依賴的自噬關鍵蛋白LC3 和ULK1的表達，而其表達量的降低則將導致自噬調節(jié)的單核細胞分化減少，單核巨噬細胞在斑塊損傷處的聚集減少，最終減輕ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化程度[19]。選擇性抑制PI3K/Akt/mTOR途徑后，可引起細胞自噬增加，減少巨噬細胞在斑塊處積聚，通過保護細胞和減少炎癥因子分泌來保護細胞[20]。同時，自噬還可通過降低炎癥小體的活性和數(shù)量來抑制凋亡，增加AS斑塊的穩(wěn)定性[21]。

3 氧化應激與自噬的相互作用及調控機制

氧化應激可以被理解為存在于胞內或胞外的過量的氧自由基，是ROS的生成和降解過程失衡的結果，在許多病理情況下細胞內ROS的過度堆積將打破細胞內在平衡，導致氧化應激壓力，線粒體功能失調，引發(fā)自噬。反之，自噬也能通過吞噬和降解ROS來對抗氧化應激帶來的損傷[22]。越來越多的研究證明這兩者在動脈粥樣硬化過程中的發(fā)揮了重要作用，特別是由于其參與了促AS關鍵因子LDL的氧化過程，ox-LDL具有細胞毒性，巨噬細胞表面的清道夫受體攝取入細胞后形成泡沫細胞。適當濃度的ox-LDL刺激平滑肌細胞可活化自噬，降解ox-LDL，保護細胞，高濃度則抑制自噬，導致凋亡增加[23]。Ox-LDL導致的線粒體DNA損傷，使Toll樣受體9（TLR9）表達增加，炎癥信號通路關鍵調節(jié)分子表達增加，自噬加強，即在AS過程中氧化應激造成的損傷的線粒體DNA可以逃避自噬，引發(fā)強烈的炎癥反應[24]。

自噬在AS進程中發(fā)揮保護還是抑制作用主要取決于細胞類型，氧化物濃度及暴露時間等。在強大的氧化應激壓力下，自噬作用就會受損而不能充分清除錯誤折疊的蛋白質及受損的細胞器。細胞線粒體損傷后伴隨產生的ROS可以調節(jié)細胞的自噬性死亡。長期或高濃度的ROS也可直接損傷溶酶體膜結構，致溶酶體酶釋放[24]。同時，過量的ROS可以增加植物血凝素樣氧化低密度脂蛋白受體-1（LOX-1）的表達，導致線粒體DNA損傷，并活化自噬作用。損傷的線粒體DNA可以逃避自噬從而引起炎癥反應[24]。蠟樣色素為一種由氧化脂質和蛋白組成的不可溶性復合體，其與巨噬細胞來源的泡沫細胞或平滑肌細胞共定位于早期AS斑塊，這些損傷的細胞中包含大量的溶酶體蠟樣色素沉積能損傷自噬作用，引起細胞凋亡[25]。

ROS與自噬間的相互作用主要是通過轉錄調控和轉錄后調控來實現(xiàn)的。在細胞核內，ROS的產生可以活化轉錄因子HIF-1、p53、FOXO3、NRF2等，使自噬相關基因BNIP3、TIGAR、LC3、BNIP3、p62等表達增加，最終導致胞漿內自噬加強。此外，內質網應激感應蛋白PERK的下游分子也可通過增加自噬相關基因的表達引起自噬[26]。自噬能清除ROS造成的線粒體損傷，目前認為溶酶體/蛋白酶途徑降解氧化蛋白是其中的主要作用機制，相關信號通路包括分子伴侶介導的自噬、線粒體自噬、p62傳遞途徑等[27-29]。OxLp（a）被認為是一種促AS因子，研究表明它能通過影響內皮細胞內ROS的產生作用于依賴ROS的PAPR-1-LKB1-AMPK-mTOR信號通路引起自噬，而超氧化物歧化酶則可抑制這種作用[30]。

4 結論

當前大量研究表明氧化應激和自噬在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用，目前人們普遍形成的共識是，自噬可以通過降解受的損的細胞內物質保護細胞對抗氧化應激，而過度激活的自噬則會引起細胞自噬性死亡，導致膠原合成減少，纖維冒變薄，斑塊不穩(wěn)定性增加及急性血管事件的發(fā)生。由于自噬是一個由多環(huán)節(jié)構成，受多種因素調節(jié)的復雜過程，探明AS斑塊損傷處ROS和自噬的發(fā)生機制，二者間相互調控的分子機制以及它們如何影響AS進展有重要意義，靶向調控氧化應激和自噬將為AS治療提供新的臨床思路。