野菊水提物和醇提物抗氧化及保肝活性研究

梁 詩，李 煊,,，陳良華，黃 雯，許傳俊，童慶宣,，林 毅，明艷林,,

(1.廈門華僑亞熱帶植物引種園/廈門市植物引種檢疫與植物源產(chǎn)物重點實驗室，福建 廈門 361002；2.華僑大學化工學院，福建 廈門 361021；3.福建省亞熱帶植物研究所/福建省亞熱帶植物生理生化重點實驗室，福建 廈門361006)

野菊Chrysanthemum indicum屬菊科多年生草本植物，廣泛分布于我國大部分地區(qū)，生于山坡草地、田邊、路旁等地帶[1]。野菊在我國已有兩千多年的藥用食用歷史，入藥最早見于《神農(nóng)本草經(jīng)》[2]，現(xiàn)收錄于《中華人民共和國藥典》(2015版)。其氣芳香，味苦、辛，性微寒，具清熱解毒、瀉火平肝的功效，用于治療疔瘡癰腫、目赤腫痛、頭痛眩暈等[3]?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，野菊提取物具有抗炎[4]、抗氧化[5—6]、抗腫瘤[7—8]、抗菌[9—10]、抗病毒[11]、保肝[12—13]等生物活性，其化學成分主要包括揮發(fā)油、萜類、多糖、黃酮、綠原酸類等[14]。野菊水提物對CCl4誘導的肝損傷有明顯的保護效果，并能顯著下調細胞色素P450 2E1(CYP2E1)蛋白水平[15]。戴勝[12]對野菊花80%乙醇提取物保肝活性成分(急性肝損傷)進行活性追蹤，發(fā)現(xiàn)醇提物、乙酸乙酯層、正丁醇層均具有保肝活性。張曉雯等[16]發(fā)現(xiàn)，野菊醇提物具有抗氧化活性，其中總黃酮和總多酚對其抗氧化活性有較大貢獻。這些研究揭示了野菊提取物在抗氧化、保肝等方面具有良好的生物活性，但這些研究主要集中于野菊花的活性，對莖、葉的活性和可利用價值關注較少，相關研究主要集中于莖葉多糖及其抗氧化研究[17—18]。本文主要通過自由基清除實驗及酒精性肝損傷細胞模型對野菊地上部分水和乙醇提取物的抗氧化活性及保肝效果進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野菊莖、葉采樣于廈門華僑亞熱帶植物引種園。HepG2細胞株購自中國科學院上海細胞庫。DMEM培養(yǎng)基購自上海源培生物科技股份有限公司；胎牛血清(FBS)購自Gibco公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH )，2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)，噻唑藍( MTT) 購自 Sigma公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

主要儀器包括Thermo MK3型酶標儀、Thermo超低溫冰箱、EYELA N-1100S-W 旋轉蒸發(fā)儀、Christ Alpha 2-4 LD plus冷凍干燥機、Thermo二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱、PerkinElmer Lambda25紫外分光光度計。

1.2 方法

1.2.1 提取物制備 稱取野菊干粉，分別用水和95%乙醇按料液比1:20 45℃超聲提取，抽濾收集濾液，減壓濃縮(45 ℃)至無醇味，得到野菊水提物和醇提物浸膏。取野菊水提物和醇提物浸膏于-80 ℃超低溫冰箱預凍12 h后，轉至Christ冷凍干燥機凍干，得到野菊水提物和醇提物干燥粉末，密封保存于-20 ℃。

1.2.2 DPPH自由基清除測定 分別取2 mL不同濃度(50、100、200、400、800、1600 μg·mL-1)的野菊水提物、醇提物以及陽性對照 V?(5、10、15、20、25、30 μg·mL-1)待測液，加入 2 mL 0.1 mmol·L-1DPPH自由基溶液，搖勻，避光30 min后，在517 nm波長處測定吸光度Ai；將DPPH自由基溶液用等體積無水乙醇代替，其他同前，測吸光度Aj；將樣品用等體積無水乙醇代替，其他同前，測吸光度Ae。DPPH自由基清除率計算公式：K= [1-(Ai-Aj)/Ae]×100%。

1.2.3 ABTS自由基清除測定 取7.9 mg ABTS溶于10 mL蒸餾水中，另取1.3 mg過硫酸鉀溶于10 mL蒸餾水中，混合兩種溶液即得ABTS儲備液，室溫條件下避光儲存過夜，使用時稀釋4倍。分別取不同濃度野菊水提物(20、40、80、160、240 μg·mL-1)、醇提物(10、20、40、80、100、120 μg·mL-1)以及陽性對照V?(2.5、5、10、15、25、30 μg·mL-1)樣品液和ABTS稀釋液等量混合，在734 nm處測吸光度值；將樣品液用等體積水代替，其他同前，測吸光度。ABTS自由基清除率計算公式：K′=[1-(Ai′-Ae′)/(Aj′-Ae′)]×100%，K′為清除率；Ai′為加試樣反應后 ABTS 溶液的吸光度；Aj′為不加試樣溶液的吸光度；Ae′為不加ABTS溶液的吸光度。

1.2.4 細胞存活率測定 96孔板接種對數(shù)生長期HepG2細胞每孔3000個，37 ℃孵育24 h，分別加入不同濃度野菊水提物(終濃度 0、31.25、62.5、125、250、500 μg·mL-1)、醇提物(終濃度 0、8、16、32、64、128 μg·mL-1)藥液，37 ℃孵育 24 h 后，每孔加入 20 μL 5 mg·mL-1MTT 培養(yǎng)液，孵育 4 h，棄上清液，每孔加100 μL DMSO，震蕩20 min后，用酶標儀在570 nm測定吸光度值。

1.2.5 野菊水提物和醇提物對酒精刺激HepG2細胞存活率測定 參考羅燕梅等[19]方法，于96孔板接種對數(shù)生長期HepG2細胞每孔3000個，37 ℃孵育24 h，分別加入不同濃度(0、5、10、20 μg·mL-1)野菊水提物、醇提物藥液預處理24 h，各組加入終濃度800 mmol·L-1乙醇誘導損傷，正常對照組加入等量培養(yǎng)液，37 ℃孵育24 h，每孔加入 20 μL 5 mg·mL-1MTT培養(yǎng)液，孵育4 h，棄上清液，每孔加100 μL DMSO，震蕩20 min后，用酶標儀測定570 nm吸光度值。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 采用GraphPad Prism 6進行數(shù)據(jù)處理分析。

2 結果與分析

2.1 野菊水提物和醇提物DPPH自由基清除能力

比較野菊水提物、醇提物與V? (陽性對照)的DPPH自由基清除能力。結果表明，DPPH自由基清除能力為 V?＞野菊醇提物＞野菊水提物(圖 1)。與陽性對照組相比，野菊提取物雖然具備一定的 DPPH自由基清除能力，但明顯偏弱，效果差10倍以上。V?、野菊水提物、野菊醇提物半效應濃度(EC50)分別為 19.02 μg·mL-1、452.57 μg·mL-1、194.93 μg·mL-1(表 1)。

圖1 DPPH自由基清除能力Fig.1 DPPH radical scavenging capacity

2.2 野菊水提物和醇提物ABTS自由基清除能力

評價野菊水提物、醇提物和 V?(陽性對照)清除 ABTS自由基的能力。與清除DPPH自由基能力類似，ABTS自由基清除能力大小依次為V?＞野菊醇提物＞野菊水提物，但野菊醇提物對ABTS自由基清除能力明顯優(yōu)于對DPPH自由基的清除能力(圖2)。V?、野菊水提物、野菊醇提物的EC50分別為 9.32、60.35、24.04 μg·mL-1(表 1)。

表1 野菊提取物自由基清除能力Table 1 Radical scavenging capacity of Chrysanthemum indicum extracts

圖2 ABTS自由基清除能力Fig.2 ABTS radical scavenging capacity

2.3 野菊水提物和醇提物對酒精誘導HepG2細胞損傷的影響

采用HepG2細胞模型評價野菊水提物和醇提物對酒精肝損傷的保護效果，首先對野菊水提物和醇提物的細胞毒性進行測定。結果表明，野菊水提物在500 μg·mL-1劑量濃度內對模型細胞株HepG2未呈現(xiàn)細胞毒性，野菊醇提物在64 μg·mL-1劑量濃度內未呈現(xiàn)明顯的細胞毒性，在128 μg·mL-1濃度下細胞活力下降至74.20%，呈現(xiàn)出低細胞毒性(圖3)。

圖3 野菊提取物對HepG2細胞的毒性Fig.3 Cytotoxicity of Chrysanthemum indicum extracts to HepG2

在對野菊水提物和醇提物細胞毒性評價的基礎上，選擇無毒濃度5、10、20 μg·mL-1進行酒精肝損傷保護效果評價。結果表明，野菊提取物對乙醇誘導的 HepG2細胞損傷有明顯的保護效果(圖 4)。與對照組相比，模型組(eth)細胞存活率分別下降至28.96%和28.37%，而使用野菊水提物和醇提物處理的藥物濃度組細胞存活率顯著增加。在800 mmol·L-1酒精損傷情況下，與對照相比，野菊水提物5、10、20 μg·mL-1處理使細胞存活率分別提高 54.02%、76.86%、68.32%；野菊醇提物 5、10、20 μg·mL-1處理使細胞存活率分別提高48.79%、71.18%、76.14%。保護效果總體上呈現(xiàn)劑量依賴性。

圖4 野菊提取物對酒精性肝損傷的保護作用Fig.4 Protective effect of Chrysanthemum indicum extracts on alcoholic liver injury

3 討論

本文采用DPPH、ABTS自由基清除實驗評價野菊莖、葉水提物和醇提物的體外抗氧化能力，并通過體外HepG2細胞模型測定野菊水提物和醇提物對酒精性肝損傷的保護作用。結果表明，野菊提取物具備一定的抗氧化活性，其中醇提物的抗氧化效果明顯優(yōu)于水提物，說明野菊中抗氧化成分主要集中于醇溶部位；野菊醇提物對ABTS自由基清除能力明顯高于對DPPH自由基的清除能力，與張曉雯等[16,20]對野菊提取物清除DPPH、ABTS自由基能力的研究結果相似。野菊總黃酮具有良好的抗氧化活性[21]，且野菊總黃酮醇提含量高于水提含量[22]。因此，野菊水提物和醇提物的抗氧化活性及其能力差別可能歸因于其中的黃酮類成分。體外酒精肝損傷細胞模型的結果表明，野菊提取物顯著地提高了酒精誘導后肝細胞的存活率，在800 mmol·L-1乙醇損傷情況下，濃度為5～20 μg·mL-1的野菊水提物和醇提物均能使細胞存活率顯著或極顯著提高，且保肝效果總體上呈現(xiàn)劑量依賴性，其中醇提物的保肝效果更佳。在酒精性肝損傷的發(fā)生、發(fā)展過程中，氧化應激和脂質過氧化作用起著重要作用。野菊的保肝成分(酒精肝損傷)可能并不完全依賴其抗氧化性能，具體的保肝活性成分及保肝機制仍有待進一步研究。本文著重從體外實驗模型闡明野菊莖、葉提取物的抗氧化能力和保肝活性，為后續(xù)野菊中保肝活性成分篩選和野菊地上部分的開發(fā)利用研究提供依據(jù)。