黃 雯,李阿池,胡應(yīng)平,楊志堅,明艷林,陳 輝
(1.福建省亞熱帶植物研究所/福建省亞熱帶植物生理生化重點實驗室,福建 廈門 361006;2.漳州市速生豐產(chǎn)林基地管理中心,福建 漳州 363000;3.福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院,福建 福州 350002)
枳椇Hovenia acerba,別名拐棗、雞爪梨,鼠李科Rhamnaceae枳椇屬植物,落葉大喬木,分布于我國華北南部至長江以南地區(qū),南亞國家也有分布,一般生于海拔2100 m以下山區(qū)疏林中、林緣、開曠地,集果、藥、材、觀賞于一身,生長快,適應(yīng)性強,極具開發(fā)價值。枳椇在福建省內(nèi)多數(shù)地區(qū)均有分布,主要分布在閩西北山區(qū),但近年來因森林破壞導(dǎo)致枳椇資源量銳減[1]。福建省背靠武夷山脈,受亞熱帶海洋性季風(fēng)氣候影響,四季分明,溫暖濕潤,光照充沛,所產(chǎn)枳椇果大、汁多、味甜而無苦澀味,在品質(zhì)、產(chǎn)量等方面都優(yōu)于長江以南其他省區(qū)。野生枳椇在福建境內(nèi)分布較廣,資源量大,具有規(guī)模栽培和產(chǎn)業(yè)化開發(fā)前景[2]。
目前,國內(nèi)外對枳椇的研究多集中在果實活性成分提取、藥理與栽培等方面[3—8],在種質(zhì)資源遺傳多樣性與DNA分子鑒別方面僅見RAPD分析[9—10]。ISSR標(biāo)記技術(shù)結(jié)合了SSR標(biāo)記和RAPD標(biāo)記的優(yōu)點,克服了RAPD標(biāo)記的缺點[11],具有樣品用量少、操作簡單、可靠性與重復(fù)性好、多態(tài)性高等優(yōu)點,已被廣泛應(yīng)用于植物遺傳多樣性研究[12—17]。本文建立和優(yōu)化了枳椇ISSR分子標(biāo)記體系,對福建省12個種源地35個枳椇單株進行遺傳多樣性分析,探討其親緣關(guān)系,旨在更好地了解福建省枳椇種質(zhì)資源情況,為枳椇良種選育奠定基礎(chǔ)。
材料來源于福建省12個種源地的35株枳椇,地理位置見表1。植物基因組DNA提取試劑盒購于杭州博日科技有限公司,引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成,ExTaqDNA聚合酶與dNTP購于大連寶生物技術(shù)有限公司。
表1 供試枳椇種源地概況Table 1 The overview of Hovenia acerba sources
1.2.1 枳椇基因組DNA制備 使用Biospin植物基因組DNA提取試劑盒提取枳椇嫩葉基因組DNA。提取的DNA經(jīng)紫外可見分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.2 枳椇ISSR反應(yīng)體系建立與優(yōu)化 參考劉興菊等[18]的鼠李科棗屬ISSR體系,設(shè)立ISSR-PCR基本反應(yīng)體系:總體積 25 μL,10×ExTaqBuffer(Mg2+plus) 2.5 μL,dNTP Mixture 375 μmol·L-1,引物0.2 μmol·L-1,DNA 模板 50 ng,ExTaq酶 1.5 U,ddH2O 15.95 μL。對引物(0.1、0.2、0.3、0.4 μmol·L-1)、dNTP Mixture (125、250、375、500 μmol·L-1)、模板 DNA (25、50、75、100 ng)、Taq酶(0.5、1.0、1.5、2.0 U)做優(yōu)化篩選。分別設(shè)置某一成分梯度變化,其他成分采用基本反應(yīng)體系,比較擴增效果。
1.2.3 DNA擴增與 PCR產(chǎn)物檢測 采用優(yōu)化的 ISSR反應(yīng)體系,在溫度梯度熱循環(huán) PCR儀(德國EPPENDORF Master-cycler05331)中擴增。將擴增產(chǎn)物與1/6體積的6×Loading Buffer混勻,上樣7.5 μL于含0.5 μg·mL-1EB的1% TAE瓊脂糖凝膠上,1×TAE電泳緩沖液,電壓110 V電泳1.5 h,用標(biāo)準λDNA(2000 Marker,博日科技)作對照,凝膠成像系統(tǒng)紫外光下觀察并成像。
1.2.4 引物篩選 以提取的多個DNA樣品為模板,對50條ISSR引物進行篩選,最終篩選出10條擴增條帶清晰、穩(wěn)定性好、多態(tài)性較高的引物(表2)。
表2 篩選出的ISSR引物序列Table 2 The sequences of ISSR primers
1.2.5 擴增與數(shù)據(jù)統(tǒng)計 利用篩選的 10條引物對35個供試材料進行PCR擴增,擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳得到指紋圖譜。人工檢測條帶的有無,當(dāng)某一位點擴增帶出現(xiàn)時,賦值為“1”,不存在時賦值為“0”,從而把圖形數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成二元數(shù)據(jù)。假定種群在這些分子標(biāo)記位點處于哈迪-溫伯格平衡狀態(tài),利用POPGENE32軟件計算遺傳參數(shù):觀測等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)、Shannon多樣性指數(shù)(I)、Nei’s遺傳距離和遺傳相似性,并根據(jù)遺傳相似性,采用NTsys 2.10e軟件進行UPGMA聚類分析,構(gòu)建親緣關(guān)系樹。
2.1.1 引物濃度 引物濃度會影響特異性,濃度過高會導(dǎo)致非特異性產(chǎn)物擴增,太低則擴增產(chǎn)物太少。從圖1: a可以看出,當(dāng)引物濃度為0.1 μmol·L-1時無條帶;當(dāng)引物濃度為0.2 μmol·L-1時擴增的條帶較模糊;當(dāng)引物濃度為0.4 μmol·L-1時條帶最明亮、清晰。因此,引物最佳濃度為0.4 μmol·L-1。
2.1.2 dNTP濃度 dNTP是PCR擴增產(chǎn)物的原料。在PCR反應(yīng)中,dNTP濃度過高會導(dǎo)致錯誤摻入,過低則影響擴增產(chǎn)量和合成效率,甚至?xí)騞NTP過早消耗而使產(chǎn)物單鏈化,影響擴增效果。不同反應(yīng)體系,dNTP最佳濃度不盡相同。從圖1: b可以看出,dNTP濃度為125 μmol·L-1時,擴增出的條帶十分模糊;dNTP濃度為500 μmol·L-1時完全沒有擴增出條帶;dNTP濃度為375 μmol·L-1時,擴增的條帶最明亮、清晰,故此濃度為最佳濃度。
2.1.3 模板DNA含量 從圖1: c可以看出,模板DNA用量為25 ng時,擴增出的條帶十分模糊;模板用量為75 ng和100 ng時擴增的帶條明亮、清晰。PCR擴增時,模板DNA含量過低會導(dǎo)致無擴增條帶;但含量過高時,由于提取的DNA純度無法達到100%,其過高含量的抑制物質(zhì)會對PCR反應(yīng)產(chǎn)生抑制。因此,選擇75 ng為最佳模板DNA用量,即濃度為3 ng·μL-1。
圖1 引物、dNTP濃度以及DNA模板、Taq酶含量對枳椇ISSR-PCR的影響Fig.1 Effect of the content of primer, dNTP, template DNA and Taq polymerase on ISSR-PCR from Hovenia acerba
2.1.4Taq酶含量Taq酶含量的選擇與模板DNA含量、擴增片段大小等有關(guān),酶量過多易發(fā)生非特異性反應(yīng),還可能增加突變的機率,尤其在進行高保真擴增時,應(yīng)盡量減少酶量。但酶量過少時反應(yīng)性能會下降。從圖1: d可以看出,當(dāng)Taq酶含量為0.5 U時條帶較淡;當(dāng)Taq酶含量為1 U時擴增效果最好;當(dāng)Taq酶含量為2 U時,出現(xiàn)非特異性擴增,帶型出現(xiàn)彌散現(xiàn)象。因此,選擇1 U為最優(yōu)酶含量進行后續(xù)實驗。
優(yōu)化后的枳椇ISSR-PCR擴增體系:反應(yīng)總體積25 μL,10×ExTaqBuffer (Mg2+plus) 2.5 μL,dNTP Mixture 375 μmol·L-1,引物 0.4 μmol·L-1,DNA 模板 75 ng,ExTaq酶 1 U,ddH2O 14.55 μL。程序:預(yù)變性 94 ℃ 5 min;變性 94 ℃ 30 s,退火 50 ℃ 1 min,延伸 72 ℃ 90 s,35 個循環(huán);最后延伸 72 ℃ 7 min。
采用優(yōu)化的ISSR反應(yīng)體系及篩選出的10條引物對35個樣品進行PCR擴增。共擴增出基因組DNA中175個位點,分子量范圍100~2000 bp。其中,多態(tài)性位點155個,占擴增總位點數(shù)的88.57%。每條引物擴增的位點數(shù) 15~23個,平均擴增位點數(shù)17.5(表3)。擴增位點數(shù)最多的為引物ISSR14,達23個;最少的為引物ISSR4、ISSR22、ISSR33,各有15個位點。多態(tài)性最好的是引物ISSR13,擴增出20個位點,多態(tài)性100.00%(圖2:A)。擴增的175個位點中,有20個為各基因型所共有,為35個材料間的同源性提供了依據(jù)。此外,不同引物擴增的位點數(shù)不同,同一引物不同基因型擴增的位點數(shù)也不一樣,充分體現(xiàn)了枳椇基因組 DNA的多態(tài)性,說明供試材料之間的遺傳差異性;10條引物在不同樣品間產(chǎn)生各自的特征帶譜,具有較好的重復(fù)性。引物 ISSR13、ISSR45對35個樣品擴增結(jié)果見圖2。
表3 ISSR各引物對35份枳椇材料的擴增位點數(shù)Table 3 Locus amplified by ISSR primers from 35 Hovenia acerba germplasms
圖2 引物ISSR13 (A)和ISSR45 (B)對35份枳椇材料的ISSR擴增圖譜Fig.2 Map of bands amplified by ISSR13 and ISSR45 from 35 Hovenia acerba germplasms
為了確定各供試材料之間的遺傳關(guān)系,通過 ISSR標(biāo)記,假定處于哈迪-溫伯格平衡下,計算 35份枳椇材料的觀測等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)、Shannon多樣性指數(shù)(I)、Nei’s(1972)遺傳距離與遺傳相似性。從表4可以看出,枳椇35份材料群體的Na為1.8857,Ne為1.4300,H為0.2572,I為0.3959,說明福建省12個種源地的枳椇種質(zhì)資源遺傳多樣性豐富,具較大開發(fā)利用價值。
根據(jù)遺傳相似性進行UPGMA聚類分析,構(gòu)建各材料的親緣關(guān)系樹狀圖,以遺傳相似系數(shù)0.74為閾值,35份材料被分成A、B、C、D四大組(圖3)。A組包含永定、建甌、清流、永春、連城、大田等6個地區(qū)的16份資源,其中永定、建甌、清流、永春的所有樣品聚在該組,說明四地的枳椇親緣關(guān)系較近,而來自大田的樣品26和連城的樣品3比較特殊,并未與其相同地區(qū)的其他樣品聚在一起。B組包含地理位置相鄰的松溪和浦城的全部樣品,說明兩地枳椇親緣關(guān)系較近。C組包含了政和、大田、沙縣、順昌、福州、連城的13份資源。D組包含連城的樣品4與政和的樣品13。連城的3份樣品分別位于 A、C、D三組,說明連城的枳椇種質(zhì)資源遺傳多樣性最豐富。
表4 供試枳椇材料遺傳多樣性參數(shù)Table 4 Summary of genic variation statistics for all loci of Hovenia acerba germplasms
圖3 35份枳椇材料ISSR標(biāo)記聚類分析Fig.3 Dendrogram of 35 accessions of Hovenia acerba generated by ISSR data using the UPGMA method
ISSR優(yōu)化體系的建立,許多物種均有研究,但是不同物種間存在一定的差異。對于未見ISSR研究的物種可參考其近緣種的ISSR反應(yīng)體系進行優(yōu)化。本研究參考了同為鼠李科的棗屬ISSR反應(yīng)體系建立枳椇ISSR反應(yīng)體系[18],且得到較好的效果。
PCR反應(yīng)涉及諸多因子,各因子均對PCR結(jié)果的穩(wěn)定性有較大影響,確定合適的反應(yīng)參數(shù)是PCR特異擴增的前提。影響PCR反應(yīng)的主要因子包括模板DNA濃度與純度,引物、dNTP、Taq酶以及Mg2+濃度等。模板DNA濃度對PCR反應(yīng)的影響,不同研究者得到的結(jié)果差異較大。本研究顯示,用于枳椇ISSR實驗的模板DNA最佳濃度為3 ng·μL-1,而ISSR-PCR反應(yīng)對DNA純度要求不高。
獲得豐富的條帶是分子標(biāo)記實驗中至關(guān)重要的環(huán)節(jié)。傳統(tǒng)的分子標(biāo)記實驗中DNA聚合酶多用rTaq酶。本研究發(fā)現(xiàn),改用ExTaq酶得到的條帶數(shù)是rTaq的兩倍,這可能與ExTaq的高保真性有關(guān),且使用ExTaq后PCR的穩(wěn)定性與可重復(fù)性也比rTaq強。
利用篩選出的10條引物對35份枳椇種質(zhì)資源進行ISSR-PCR擴增,共擴增出基因組DNA中175個位點,其中多態(tài)性位點有155個,占擴增總位點數(shù)的88.57%,說明35份枳椇種質(zhì)資源具有較高的遺傳多樣性。對35份枳椇種質(zhì)資源進行聚類分析,以遺傳相似系數(shù)0.74為閾值,可分成四大組。從聚類結(jié)果看,來自福建省12個種源地的35份枳椇種質(zhì)資源的親緣關(guān)系既與生態(tài)環(huán)境、地理來源等地域分布有關(guān),也與人類活動的干預(yù)密不可分。
首先,生態(tài)環(huán)境相同、地理來源一致的枳椇種質(zhì)資源遺傳關(guān)系較近,能聚成一組,具有明顯的地域分布規(guī)律。如閩北相鄰的松溪、浦城所有樣品聚在一起,組成了B組;各縣的大多數(shù)枳椇資源較為明顯地在較近的遺傳距離上聚在一起,如永定的樣品1和2,大田的樣品6、7、8,沙縣的樣品9、10、11,政和的樣品14、15、16、17,建甌的樣品28、29、30、31、32、33、34、35等。
其次,鳥類、獸類、人類的活動對福建省枳椇種質(zhì)資源的親緣關(guān)系影響較大。來自大田的樣品26與大田其他3株枳椇遺傳距離相去甚遠,卻與清流、永定、建甌、永春的樣品聚在一組,其中樣品26與清流的樣品25遺傳相似系數(shù)高達0.84。據(jù)調(diào)查,大田樣品26植株胸徑十分粗壯,達88 cm,樹齡也比其他枳椇高,應(yīng)在60年以上,每年產(chǎn)生大量的種子散落地表。永春、永定、大田、清流、建甌五地分屬福建省南部、中部和北部,其枳椇種質(zhì)資源在分子水平上反映出的較近的親緣關(guān)系與它們所處的地理位置形成鮮明的反差。位于北部的建甌和位于東南部的永春、西南部的永定等地相隔三四百公里,且福建是多山地區(qū),各地之間有許多山巒相隔,清流、永定采集的枳椇種質(zhì)資源均為野生型,可排除人為引種的可能,推測可能來源于鳥類或獸類遷徒活動傳播的枳椇種子。而建甌枳椇種植于庭院,應(yīng)是人為引種自其他地區(qū)。福州的樣品12與沙縣3份材料聚在一起,有較為接近的親緣關(guān)系,由于沙縣的3株枳椇皆為人工種植的庭院樹種,而福州的枳椇極有可能是野生的,故沙縣3份材料有人為引種自福州的可能。來自政和的樣品13與連城的樣品4聚為一組,與其他枳椇種質(zhì)資源的親緣關(guān)系都較遠。采樣時調(diào)查得知,樣品13與4皆為人工種植,可能由其他較遠地區(qū)引種而來。綜上,鳥類、獸類的活動,以及人類的引種馴化活動促進了福建省枳椇種質(zhì)資源的遺傳多樣性。
研究表明,35份福建省枳椇種質(zhì)資源的最大遺傳距離為0.6004,最大相似性為0.9486,遺傳多樣性較為豐富,這與福建省的丘陵多山地貌、背靠武夷山脈的自然地理環(huán)境以及受亞熱帶海洋性季風(fēng)氣候的影響、四季分明、陽光充沛、溫暖濕潤的氣候條件息息相關(guān)。人為因素對福建省枳椇種質(zhì)資源的影響較大,引種馴化豐富了福建省枳椇種質(zhì)資源的遺傳多樣性,然而近年來,因森林的破壞或人為的各種因素對枳椇進行砍伐,造成其資源量銳減。一個物種或居群的遺傳多樣性程度越高、變異越豐富、資源蘊藏量越大,對環(huán)境的適應(yīng)能力就越強。因此,對福建省枳椇種質(zhì)資源的保護刻不容緩。
ISSR分子標(biāo)記能較好地反映枳椇種質(zhì)資源的遺傳差異,揭示其遺傳多樣性。供試的福建省12個種源地35份枳椇材料存在著豐富的遺傳多樣性。研究結(jié)果對福建省枳椇種質(zhì)資源的開發(fā)利用、良種選優(yōu)、雜交育種、資源保護等提供了分子水平的理論依據(jù)。