硒、鋅元素配施對紫花苜蓿產(chǎn)量、植株體內(nèi)硒鋅積累和氨基酸含量的影響

田春麗,李斌,劉芳,趙穎,劉世亮,介曉磊,4,胡華鋒

(1.河南農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院,河南 鄭州 450002;2.河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學院,河南 中牟 451450;3.河南省農(nóng)業(yè)廳中藥材生產(chǎn)技術服務中心,河南 鄭州 450008;4.商丘師范學院,河南 商丘 476000;5.河南牧業(yè)經(jīng)濟學院,河南 鄭州 450011)

紫花苜蓿(Medicagosativa)是世界上廣泛分布且享有盛譽的優(yōu)良牧草，因其產(chǎn)量高，適口性好，且粗蛋白、維生素和礦物質含量豐富，氨基酸組成比較齊全，素有“牧草之王”的美稱。在紫花苜蓿種植生產(chǎn)過程中，大量元素肥料(氮、磷、鉀肥)和微量元素肥料的配合施用不僅可以提高苜蓿的產(chǎn)量，也能提高其中的微量元素，從而有效地補給畜禽動物，改善其營養(yǎng)條件。研究認為，硒是人類和動物生命活動必需的微量元素。然而我國2/3地區(qū)屬缺硒地區(qū)，其中含量≤0.02 mg·kg-1的占29%，為嚴重缺硒地區(qū)[1]。通過土壤施硒，提高植物體內(nèi)硒含量，從而提高食物鏈硒水平，增加人與動物對硒的攝入量是人—畜補硒的重要途徑。近年來，有關硒對牧草的影響已引起了部分學者的關注。Hu等[2]研究表明，適量硒可促進紫花苜蓿生長，增加產(chǎn)量，并可生產(chǎn)富硒紫花苜蓿產(chǎn)品；翁伯琦等[3]研究表明，施硒能提高圓葉決明(Chamaecristarotundifolia)生長、改善品質，并提高其根瘤固氮能力，隨施硒用量的增加，植株硒含量增幅可達302.7%～1778.4%。另外，有研究表明，缺鋅會嚴重影響紫花苜蓿產(chǎn)量和品質，鋅作基肥能提高紫花苜蓿當年的產(chǎn)量，劉世亮等[4]研究表明，噴施硫酸鋅能顯著提高紫花苜蓿草產(chǎn)量，以噴施濃度為500 mg·L-1效果最好，并提高相關品質指標，但噴施濃度過高，則會抑制紫花苜蓿的生長，降低其品質。

牧草的氨基酸含量和組成是評價其品質的重要指標。氨基酸含量的高低、組成種類及比例直接影響到牧草最終的品質以及家畜的生長及生產(chǎn)效率。前人對不同種質材料牧草中總氨基酸和各種游離氨基酸含量的研究有較多的報道[5-7]。但從施肥和植物營養(yǎng)角度研究不同營養(yǎng)元素對紫花苜蓿氨基酸組成特點和評價其營養(yǎng)價值的報道尚不多見。因此，本試驗以紫花苜蓿為研究對象，通過在缺硒缺鋅及硒鋅有效性較低的石灰性潮土上基施硒、鋅微肥的盆栽試驗，研究硒、鋅單施和配施對紫花苜蓿產(chǎn)量、硒鋅積累量和氨基酸組成的影響，并采用非生物學評價法中的氨基酸評分(amino acid score, AAS)、化學評分(chemical score, CS)及必需氨基酸指數(shù)(essential amino acid index, EAAI)3個指標，對其營養(yǎng)價值和飼用價值進行評價，以期為紫花苜蓿合理施用硒、鋅微肥，了解微肥施用對提高紫花苜蓿品質的影響提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試土壤

供試土壤采自河南省農(nóng)業(yè)高新科技園區(qū)的石灰性輕壤質潮土。土壤(0～20 cm)基本理化性狀為：土壤有機質含量為10.7 g·kg-1，堿解氮為55.2 mg·kg-1，速效磷為11.5 mg·kg-1，速效鉀為85.0 mg·kg-1，有效鋅0.64 mg·kg-1，有效硒0.008 mg·kg-1，pH值為7.88。劉錚[1]曾指出，土壤硒含量≤0.02 mg·kg-1時為嚴重缺硒，鋅含量為0.5～1.0 mg·kg-1為缺鋅，可見該區(qū)土壤屬于嚴重缺硒缺鋅土壤區(qū)。

1.2 供試材料

供試氮肥為尿素[CO(NH2)2，含N 46%]；鉀肥為硫酸鉀(K2SO4，含K2O 50%)；磷肥為過磷酸鈣(含P2O512%)；鋅肥為分析純七水硫酸鋅(ZnSO4·7H2O)；硒肥為分析純亞硒酸鈉(Na2SeO3·5H2O)。

供試紫花苜蓿品種為三得利，該品種是從美國引種的優(yōu)質牧草品種之一，其春季返青早，生長迅速，夏秋季生長旺盛，再生速度快，產(chǎn)量高；莖稈柔嫩、適口性好、蛋白質含量高、消化率好；抗凍害能力強，秋眠級數(shù)4.0，且抗病蟲害和抗倒伏能力強，具有很高的社會經(jīng)濟效益。

1.3 試驗設計

試驗于2012年3—8月在河南省農(nóng)業(yè)高新科技園區(qū)網(wǎng)室進行。采用鋅、硒兩因素三水平完全設計。鋅和硒三水平分別為：每kg干土施純鋅(Zn)量折合為0、0.10、0.40 g·kg-1(分別用Zn0、Zn1、Zn2表示)，每kg干土施純硒(Se)量折合為0、0.30、1.80 mg·kg-1(分別用Se0、Se1、Se2表示)，共9個處理組合，分別為：1)對照(Se0Zn0)；2)低鋅(Se0Zn1)；3)高鋅(Se0Zn2)；4)低硒(Se1Zn0)；5)低硒低鋅(Se1Zn1)；6)低硒高鋅(Se1Zn2)；7)高硒(Se2Zn0)；8)高硒低鋅(Se2Zn1)；9)高硒高鋅(Se2Zn2)，每個處理重復3次，共27盆。各處理均基施氮、磷、鉀肥和腐殖酸(富啡酸)肥(河南省化學研究所提供，純度≥50%)。氮、磷、鉀及富啡酸(fulvic acid, FA)用量(風干土計)分別為N 0.2 g·kg-1、P2O50.35 g·kg-1、K2O 0.33 g·kg-1、FA 0.25 g·kg-1，在裝盆時一次性施入。

盆栽試驗用盆為白色不透光塑料盆，每盆裝干土10 kg。裝盆前，先取1 kg干土分別與硒、鋅微肥混勻(硒以Na2SeO3·5H2O溶液形式加入，鋅以ZnSO4·7H2O粉末形式加入)，再與氮磷鉀及富啡酸混勻，然后與剩余的盆栽土混勻。裝土過程中保證土壤松緊合適；裝土9.0 kg以后，灌水2000 mL，水分完全入滲后，每盆均勻播種紫花苜蓿種子30～40粒，并將剩余土覆蓋于土面，覆土厚度約1.5 cm。苗期間苗至10株，在植株生長期間，適時松土、澆水，防治蟲害。

1.4 測定項目及方法

1.4.1樣品采集 分別于2012年的6月27日、7月29日(初花期)取樣刈割，刈割時留茬5 cm左右，刈割后立即稱鮮重。從所取新鮮樣品中隨機取150 g，先用自來水沖洗，再用去離子水沖洗干凈，用粗濾紙擦干，于105 ℃殺青15 min后，于65 ℃烘干至恒重，計算含水率，按下面的公式計算每盆地上部的干草產(chǎn)量。粉碎過20 mm篩，兩茬混合均勻后備用。

每盆干草產(chǎn)量(g)=鮮草量(g)×(1-含水率)

1.4.2植株硒、鋅的測定 植株全硒、全鋅分別采用GB/T13883-2008法和濕灰化法測定[8]。硒(鋅)積累量按“硒(鋅)積累量=硒(鋅)含量×干物質”進行計算。

1.4.3紫花苜蓿氨基酸含量和組分的測定 準確稱取植物樣200～500 mg于試管中，加入10 mL 6 mol·L-1的鹽酸溶液(含0.5%巰基乙酸)進行水解，冷凍后抽真空，再充入氮氣封口，將試管放入110 ℃的烘箱中水解22～24 h，冷卻后過濾到50 mL容量瓶中，并用無離子水稀釋至刻度，過濾。準確取10 μL樣品液于5 mm×50 mm小試管中，真空抽干，加入20 μL衍生緩沖液，于混合器上振蕩30 s，加入20 μL衍生試劑，封口振蕩30 s，于60 ℃培養(yǎng)30 min，冷卻后加入160 mL平衡緩沖液，振蕩混合30 s。然后用氨基酸自動分析儀(日立L-8800，日本)檢測紫花苜蓿中的17種氨基酸(除色氨酸)含量。

1.5 氨基酸品質評價方法

采用非生物學評價法。此類評價方法一般不需進行復雜而費時的動物試驗，而是根據(jù)供試蛋白質的氨基酸組成及比例與參照蛋白質的氨基酸組成及比例進行比較分析，特別是根據(jù)其中所含必需氨基酸的組成及比例評價其價值，或根據(jù)經(jīng)驗方法進行測定。

1.5.1氨基酸評分(AAS) 將必需氨基酸(mg·100 g-1干重)含量換算為每克蛋白質中含氨基酸毫克數(shù)(除以占干重蛋白質分數(shù))，然后根據(jù)Bano[9]的方法，與1973年聯(lián)合國糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織(Food and Agriculture Organization/World Health Organization, FAO/WHO)[10]暫定氨基酸計分模式和以雞蛋蛋白質作為理想蛋白質進行比較，即氨基酸評分為試驗蛋白質中某一必需氨基酸占FAO/WHO評分模式中相應氨基酸含量的百分比?？砂聪率接嬎悖?/p>

式中：Ax為待測蛋白質中某一必需氨基酸的含量；As為FAO/WHO評分模式中相應氨基酸含量。

AAS值越接近100，與評分模式氨基酸組成越接近，蛋白質價值就越高。

1.5.2化學評分(CS) 采用FAO在1970年推薦的方法[11]，用來測定評價待測蛋白質中某一必需氨基酸的相對含量(與其必需氨基酸總量之比)與標準雞蛋白中相應必需氨基酸相對含量的接近程度?？砂聪率接嬎悖?/p>

式中：Ax為待測蛋白質中某一必需氨基酸的含量；Ae為待測蛋白質中必需氨基酸的總含量；Ex為標準雞蛋白中相應必需氨基酸的含量；Ee為標準雞蛋白中必需氨基酸的總含量。

CS值越接近100，與標準蛋白的組成越接近，營養(yǎng)價值就越高。

1.5.3必需氨基酸指數(shù)(EAAI)的計算及評價參比物的確定 利用Penaflorida[12]評價飼料蛋白源時采用的公式計算EAAI值。

式中：aai為牧草中某種必需氨基酸占必需氨基酸總量的百分數(shù)；AAi為參比蛋白中該必需氨基酸占必需氨基酸總量的百分數(shù)；n為計算中涉及的必需氨基酸數(shù)。由于 EAAI 反映了飼料蛋白源的必需氨基酸組成與喂養(yǎng)對象的必需氨基酸組成的擬合程度，因此可以用喂養(yǎng)動物蛋白為參比，用 EAAI 評價蛋白源對該動物的營養(yǎng)價值。

分別選用牛肉[13]、兔肉[14]及山羊肉[15]背肌最長肌氨基酸為參比，并根據(jù)馮東勛等[16]提出的標準評價牧草蛋白質的營養(yǎng)價值，即：當n=6～12時，EAAI>0.95為優(yōu)質蛋白源；0.86≤EAAI≤0.95為良好蛋白源；0.75≤EAAI≤0.86為可用蛋白源；EAAI≤0.75為不適蛋白源。

1.6 數(shù)據(jù)處理方法

采用Excel 2013和DPS 7.05軟件進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析，并采用Duncan新復極差法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 不同處理對紫花苜蓿干草產(chǎn)量的影響

由表1可知，除Se0Zn1(低鋅處理)對草產(chǎn)量增產(chǎn)效果不顯著外，其余施肥處理均使紫花苜蓿干草產(chǎn)量較對照(Se0Zn0)相比有所增加。第一茬各處理產(chǎn)量均高于第二茬各相應處理，其中第一茬干草產(chǎn)量占總干草產(chǎn)量的52.49%～55.94%。

在第一茬中，以Se1Zn1處理產(chǎn)量最高，其次為Se1Zn2、Se2Zn0，三者間差異不顯著。在相同硒水平下，隨鋅施用量的提高干草產(chǎn)量也不同程度變化，在不同硒水平下變化規(guī)律不同：在單施鋅肥(Se0條件下)時，高鋅顯著提高苜蓿干草產(chǎn)量，而低鋅處理產(chǎn)量卻有所降低；在低硒Se1條件下，配施鋅肥極顯著提高苜蓿干草產(chǎn)量，且隨鋅用量的增加先升后降， 以Se1Zn1處理的產(chǎn)量最高，達到23.5 g·pot-1；在高硒Se2條件下，產(chǎn)量隨鋅用量的增加而下降，且高硒低鋅與高硒高鋅兩個處理間差異不顯著。同樣可以看出，不同施鋅量時，硒對干草產(chǎn)量影響規(guī)律也不同： 在Zn0時，產(chǎn)量隨施硒量的提高顯著增產(chǎn)；在低鋅及高鋅條件下，配施硒也顯著提高苜蓿產(chǎn)量?？傮w來看，硒鋅配施對草產(chǎn)量增產(chǎn)效果明顯優(yōu)于微肥單施，以低硒條件下配施鋅肥效果最好；單施硒肥增產(chǎn)效果好于單施鋅肥，且草產(chǎn)量均隨微肥用量增加而增加，說明硒是提高苜蓿干草產(chǎn)量的主要因素，鋅僅起到次要作用，并且兩者配施效果最好。

表1 硒、鋅配施對紫花苜蓿地上部干草產(chǎn)量的影響Table 1 Effects of Se and Zn combined application on herbage yield of alfalfa (g·pot-1)

注：同列不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

Note:Bars with different capital letters show significant difference atP<0.01, and the different small letters indicate significant difference atP<0.05 by the Duncan-test. The same below.

第二茬中，苜蓿草產(chǎn)量大小順序如下：Se2Zn1>Se1Zn1>Se2Zn0>Se2Zn2>Se1Zn2>Se1Zn0>Se0Zn2>Se0Zn1>Se0Zn0，但前5個處理之間差異均不顯著。單施低硒處理Se1Zn0與單施高鋅處理Se0Zn2與對照相比雖有顯著增產(chǎn)，但增幅較低，分別僅為12.48%和6.78%，且兩者之間無顯著差異;與第一茬相似，單施低鋅Se0Zn1處理與對照Se0Zn0差異不顯著。不同處理間總干草產(chǎn)量變化規(guī)律與第一茬相似，以Se1Zn1、Se2Zn0、Se2Zn1處理產(chǎn)量較高，三者之間差異不顯著，但與其余處理均有顯著差異。

2.2 不同處理對紫花苜蓿硒、鋅含量與積累量的影響

2.2.1對硒含量與積累量的影響 由表2可知，施硒能顯著提高紫花苜蓿硒含量，且硒含量隨硒施用量的增加呈直線上升，增幅高達181.82%～1127.27%，這與紫花苜蓿對硒具有較強的吸收和富集能力有關。在不施硒肥僅施鋅肥時，苜蓿硒含量隨施鋅量的增加呈降低趨勢，雖然低鋅處理Se0Zn1與高鋅處理Se0Zn2之間差異不顯著，但兩者的硒含量均極顯著低于對照Se0Zn0，降幅依次為36.36%和45.45%。而低硒時，Se1Zn0、Se1Zn1、Se1Zn2處理的苜蓿硒含量均顯著高于Se0Zn0處理，且三者之間均差異顯著。可見，在施少量硒肥時，苜蓿硒含量顯著提高，配施鋅肥后極顯著促進苜蓿對硒的吸收；高硒處理時，隨施鋅量的提高也顯著地提高硒含量，并顯著地高于Se0Zn0處理?？傊?，在嚴重缺硒地區(qū)通過土壤基施硒肥能有效提高紫花苜蓿硒含量，且對于富集能力較強的苜蓿而言，高硒并未出現(xiàn)中毒現(xiàn)象，同時，在低硒條件下，配施高鋅使硒極顯著富集于苜蓿體內(nèi)，硒與鋅表現(xiàn)為協(xié)同效應。

硒積累量不僅與紫花苜蓿硒含量有關，還與苜蓿生物量密切相關，由表2可見，紫花苜蓿硒積累量隨硒施用量增加而迅速增加，硒積累量最高值出現(xiàn)在Se2Zn2處理，是對照處理積累量的15.07倍。同時也可以看出，在Se0情況下，紫花苜蓿硒積累量隨鋅施用量的增加而有所減少，但在有硒施入土壤情況下，紫花苜蓿硒積累量隨鋅施用量的增加而顯著增加，說明無外源硒施入時，施鋅抑制了紫花苜蓿對硒的積累，二者呈拮抗關系，而當硒和鋅同時施入時，二者呈協(xié)同關系。

2.2.2對鋅含量與積累量的影響 由表3可見，對于不施鋅處理中，Se1Zn0及Se2Zn0的紫花苜蓿鋅含量低于對照Se0Zn0， 表明單施硒抑制了苜蓿對鋅的吸收，硒與鋅表現(xiàn)為拮抗作用；在低鋅和高鋅處理中，紫花苜蓿鋅含量均隨施硒量的增加表現(xiàn)出先升后降趨勢，表明適量施硒顯著促進紫花苜蓿對鋅的吸收，但過量施硒反而不利于苜蓿對鋅的吸收。同時可以發(fā)現(xiàn)，在相同施硒量處理中，紫花苜蓿鋅含量均隨施鋅量的增加而增加，說明基施鋅可促進紫花苜蓿對鋅的吸收，提高鋅含量。

鋅積累量與其含量和紫花苜蓿產(chǎn)量相關。由表3可見，鋅含量最高值在Se1Zn2處理，因此該處理的鋅積累量最高，其次為Se2Zn2處理，而且兩者之間差異極顯著，即在產(chǎn)量差異不大的情況下，紫花苜蓿Se、Zn含量的增加決定了紫花苜蓿Se和Zn的積累量。

表2 硒、鋅配施對紫花苜蓿硒含量及積累量的影響 Table 2 Effects of Se and Zn combined application on Se content and accumulation of alfalfa

注：表中數(shù)據(jù)為兩茬數(shù)值的加權平均值。下同。

Note:The data in the Table is the weighted average value of the two cuts values. The same below.

表3 硒、鋅配施對紫花苜蓿鋅含量及積累量的影響 Table 3 Effects of Se and Zn combined application on Zn content and accumulation of alfalfa

2.3 不同處理對紫花苜蓿氨基酸含量和組分的影響

2.3.1對紫花苜蓿氨基酸總量的影響 由表4可知，各處理紫花苜蓿總氨基酸含量變化幅度在15.88～18.89 g·100 g-1(以干重計)，氨基酸含量大小順序如下：Se1Zn1>Se1Zn2>Se0Zn2>Se1Zn0>Se2Zn1>Se0Zn1& Se2Zn0>Se0Zn0>Se2Zn2。具體而言，Se1Zn1處理(18.89 g·100 g-1)、Se1Zn2處理(18.70 g·100 g-1)和Se0Zn2處理(18.27 g·100 g-1)分別比對照Se0Zn0(16.39 g·100 g-1)提高了15.3%、14.1%和11.5%(P<0.05，下同)，而Se1Zn0處理(17.86 g·100 g-1)與Se2Zn1處理(17.31 g·100 g-1)的增加幅度略低，分別為9.0%和5.6%，Se0Zn1處理(16.90 g·100 g-1)與Se2Zn0(16.89 g·100 g-1)的增幅更低，僅為3.11%和3.05%，而Se2Zn2處理反而以3.11%的幅度降至15.88 g·100 g-1。

2.3.2對各氨基酸含量及組成的影響 因為色氨酸需要單獨的方法進行測定，故本研究只測得除色氨酸外的17種氨基酸含量。由表4可見，對17種氨基酸中至少4種含量及組成影響較大的處理是Se1Zn0、Se1Zn1、Se1Zn2和Se2Zn2，前3個處理提高了不同種類氨基酸含量及總氨基酸含量，與之相反的是Se2Zn2降低了多種氨基酸含量及總氨基酸含量。具體而言，Se1Zn0顯著提高了纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸3種必需氨基酸及精氨酸、甘氨酸、丙氨酸、酪氨酸4種非必需氨基酸含量，同時顯著降低了非必需氨基酸中的天門冬氨酸和組氨酸及必需氨基酸中的蘇氨酸含量；Se1Zn1顯著提高了非必需氨基酸中天門冬氨酸和酪氨酸及必需氨基酸中的蘇氨酸和賴氨酸；Se1Zn2顯著提高了非必需氨基酸中脯氨酸和蛋氨酸及必需氨基酸中苯丙氨酸和組氨酸含量，并降低胱氨酸含量；而Se2Zn2降低了8種氨基酸含量，其中必需氨基酸為蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和賴氨酸，非必需氨基酸為谷氨酸、甘氨酸和酪氨酸。

必需氨基酸中，Se1Zn1處理的蘇氨酸達到最大值，為0.95 g·100 g-1，比對照Se0Zn0(0.82 g·100 g-1)提高了15.9%；Se1Zn0(0.74 g·100 g-1)和Se1Zn2(0.77 g·100 g-1)均顯著低于對照，分別降低了9.8%和6.1%。對纈氨酸而言，Se1Zn0處理含量最高，Se1Zn2處理含量次之，另外，除Se2Zn2(0.97 g·100 g-1)與Se0Zn1(0.95 g·100 g-1)含量較低，與對照無顯著差異外，其余所有處理均顯著高于對照。Se1Zn2處理蛋氨酸含量(0.12 g·100 g-1)顯著高于其余處理，而Se2Zn2處理蛋氨酸含量(0.05 g·100 g-1)顯著低于其余處理，表明高硒處理會影響含硫氨基酸的合成。不同處理對異亮氨酸和亮氨酸的影響相似，總體表現(xiàn)為Se1Zn0>Se1Zn2>Se2Zn1>Se0Zn2>Se1Zn1>Se2Zn0>Se0Zn0。苯丙氨酸含量較高的處理依次為Se0Zn2(1.16 g·100 g-1)、Se1Zn2(1.16 g·100 g-1)、Se1Zn0(1.07 g·100 g-1)、Se1Zn1(1.06 g·100 g-1)，且均與對照差異顯著，但Se0Zn2與Se1Zn2、Se1Zn0與Se1Zn1之間差異不顯著，表明高鋅或低硒均可提高苯丙氨酸含量。賴氨酸含量較高的處理依次為Se1Zn1(1.04 g·100 g-1)、Se1Zn2(0.96 g·100 g-1)及 Se0Zn2(0.94 g·100 g-1)，比對照Se0Zn0(0.83 g·100 g-1)分別提高了25.3%、15.7%及13.3%，含量低于對照并與之達到顯著差異的處理為Se2Zn2(0.66 g·100 g-1)、Se2Zn0(0.77 g·100 g-1)、Se0Zn1(0.80 g·100 g-1)，降幅依次為20.5%、7.2%及3.6%?？梢?，低硒配施鋅肥或單施高鋅可顯著提高賴氨酸含量，而高硒配施高鋅大幅度降低賴氨酸含量，單施高硒或單施低鋅也不利于賴氨酸含量的提高。

在非必需氨基酸中，僅有Se1Zn1處理的天門冬氨酸含量(3.40 g·100 g-1)顯著高于對照Se0Zn0(3.36 g·100 g-1)，Se0Zn1處理含量與對照無差異，其余處理天門冬氨酸含量均顯著低于對照，Se2Zn1(2.10 g·100 g-1)處理在顯著降低天門冬氨酸含量(降幅為37.50%)的同時顯著提高了谷氨酸含量(增幅為34.3%)，Se1Zn0降低了絲氨酸含量卻顯著提高了精氨酸和甘氨酸含量；對脯氨酸而言，Se1Zn2(1.47 g·100 g-1)與Se1Zn1(1.39 g·100 g-1)

顯著提高了其含量，與對照相比，所有處理均顯著提高了丙氨酸含量，Se1Zn0處理含量最高，除Se1Zn2處理胱氨酸含量與對照無顯著差異外，其他處理都顯著提高了胱氨酸含量，尤以Se2Zn0(0.08 g·100 g-1)含量最高；僅有Se1Zn2處理提高了組氨酸含量，其余處理均顯著降低了組氨酸含量；對酪氨酸而言，Se1Zn1(0.50 g·100 g-1)、Se2Zn1(0.50 g·100 g-1)及Se1Zn0(0.47 g·100 g-1)處理顯著提高了酪氨酸含量，而Se2Zn2(0.35 g·100 g-1)顯著低于對照Se0Zn0(0.42 g·100 g-1)，其余處理變化不明顯，與對照差異不顯著。

此外，不同處理中含量較高的6種氨基酸的含量由高到低的排列次序基本相同，都是天門冬氨酸>谷氨酸>脯氨酸&亮氨酸>丙氨酸>甘氨酸；而含量較低的4種氨基酸基本上都是胱氨酸<蛋氨酸<酪氨酸<組氨酸，此結果與王照蘭等[5]的研究結論基本一致。

2.3.3對必需氨基酸總量的影響 由表4可見，各處理必需氨基酸含量(E)變化范圍為5.11～6.45 g·100 g-1，仍以Se2Zn2處理含量(5.11 g·100 g-1)最低，顯著低于對照(5.29 g·100 g-1)；除Se0Zn1處理E與對照差異不顯著外，其余各處理均顯著提高E含量，E含量排在前4位的是：Se1Zn2(6.45 g·100 g-1)>Se1Zn0(6.35 g·100 g-1)>Se0Zn2(6.34 g·100 g-1)>Se1Zn1(6.26 g·100 g-1)，表明低硒高鋅、單施低硒、單施高鋅及低硒低鋅顯著提高紫花苜蓿必需氨基酸含量，從而顯著提高苜蓿蛋白品質。

2.3.4對E/T和E/N值的影響 由表4可知，Se1Zn0、Se2Zn1、Se0Zn2、Se1Zn2處理的E/T值較高，分別為35.54%、35.19%、34.67%及34.50%，比對照Se0Zn0(32.25%)更接近40%，而E/N相應分別為55.13%、54.30%、53.08%和52.67%，與FAO/WHO[10]提出的E/T約為40%、E/N約為60%[17]相接近，而越接近FAO/WHO標準的產(chǎn)品的蛋白品質也越高。雖然Se1Zn2處理顯著提高了苜蓿必需氨基酸含量，但由于相應處理下非必需氨基酸增加量較多，所以必需氨基酸在總氨基酸中所占的百分率有所降低，苜蓿的營養(yǎng)價值也隨之下降。E/N指標變化規(guī)律與E/T指標變化規(guī)律相似，同樣表現(xiàn)為Se1Zn0、Se2Zn1、Se0Zn2處理較高，Se2Zn2與Se0Zn1較低。結合E/T值和E/N值來看，Se1Zn0與Se0Zn2處理不僅提高了必需氨基酸的含量和比例，而且使E/T接近40%和E/N接近60%，使紫花苜蓿氨基酸的組成比例與FAO/WHO推薦的成人氨基酸模式基本符合，因此其營養(yǎng)價值較高。必需氨基酸總量百分比高于FAO/WHO模式(35%)的處理為Se1Zn0(35.54%)、Se2Zn1(35.19%)，與之相近的處理為Se0Zn2(34.67%)和Se1Zn2處理(34.50%)，其余處理均低于標準模式，且所有處理必需氨基酸總量百分比均低于雞蛋模式(49.7%)。另外，紫花苜蓿蛋白質中4種呈味氨基酸天門冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸含量較高，占總氨基酸量的38.0%～43.8%，具有較好的適口性，尤以Se0Zn1處理口感最好。

綜上所述，對氨基酸含量及組成影響最大的處理是Se1Zn0、Se1Zn1、Se1Zn2和Se2Zn2；對氨基酸總量影響最大的是：Se1Zn1、Se1Zn2、Se0Zn2、Se1Zn0；顯著提高必需氨基酸總量的處理是：Se1Zn2、Se1Zn0、Se0Zn2、Se1Zn1；對E/T指標而言，Se1Zn0、Se2Zn1、Se0Zn2、Se1Zn2處理效果較為理想，E/N值來看，Se1Zn0與Se0Zn2處理不僅提高了必需氨基酸的含量和比例，而且使E/T接近40%和E/N接近60%，更符合FAO/WHO[10]推薦的成人氨基酸模式，其營養(yǎng)價值較高，而Se2Zn2處理效果最差。

2.4 不同處理對苜蓿營養(yǎng)價值及飼用價值的影響

紫花苜蓿蛋白的氨基酸評分和化學評分見表5。由表5可知，所有處理紫花苜蓿蛋白的第一限制氨基酸均為含硫氨基酸(蛋氨酸+胱氨酸)，Se0Zn0、Se2Zn0和Se1Zn1處理紫花苜蓿第二限制氨基酸為異亮氨酸，其余6個處理的第二限制氨基酸為賴氨酸，但苯丙氨酸+酪氨酸、纈氨酸含量豐富，蘇氨酸和亮氨酸含量也較豐富，因此，紫花苜?？勺鳛閮?yōu)質的蛋白飼料與含硫氨基酸飼料合理搭配飼用。

從表6可知，除硫氨基酸(蛋氨酸+胱氨酸)和賴氨酸外，其余氨基酸的AAS均大于或接近100，說明紫花苜蓿中必需氨基酸含量是比較符合營養(yǎng)模式的。但各處理紫花苜蓿含硫氨基酸(蛋氨酸+胱氨酸)的含量極低，可能與鋅、硒的施用有關。依據(jù)表6還可見，從紫花苜蓿氨基酸化學評分(CS)來看，仍是含硫氨基酸(蛋氨酸+胱氨酸)數(shù)值最低，其次是賴氨酸，CS較低的處理分別為Se1Zn0(84)、Se2Zn0(84)、Se2Zn1(87)、Se2Zn2(81)，對照(Se0Zn0)異亮氨酸的CS(88)也較低，其他氨基酸的CS都接近或高于100，說明除硫氨基酸(蛋氨酸+胱氨酸)及賴氨酸外，紫花苜蓿其他必需氨基酸與雞蛋蛋白質相應必需氨基酸相比的營養(yǎng)價值較高，施硒除了影響含硫氨基酸的含量，也降低了賴氨酸含量。

表5 不同處理苜蓿蛋白和參比蛋白各必需氨基酸含量(mg·g-1粗蛋白) Table 5 Composition of essential amino acid in the alfalfa and the reference object (mg·g-1 crude protein)

表6 不同處理苜蓿蛋白氨基酸評分(AAS)和化學評分(CS) Table 6 Comparison of the amino acid score (AAS) and chemical score (CS) of alfalfa

飼養(yǎng)動物對飼料中氨基酸的需求與其自身的氨基酸組成顯著相關，必需氨基酸指數(shù)(EAAI)反映了飼料蛋白源的必需氨基酸組成與飼養(yǎng)對象的必需氨基酸組成的擬合程度，因而可以更加準確、科學地評價飼料蛋白源的營養(yǎng)價值。由表7可知，各處理紫花苜蓿對牛肉的EAAI值為0.885～0.913，對兔肉為0.862～0.889，對山羊肉為0.891～0.919，因此，各處理紫花苜蓿對牛、兔及山羊均為良好蛋白源，不同處理間差異不顯著。

3 討論

3.1 硒、鋅配施對紫花苜蓿干草產(chǎn)量及硒、鋅吸收的影響

表7 不同處理必需氨基酸指數(shù)(EAAI)比較 Table 7 Comparison of the essential amino acid index

研究表明，施用硒肥不僅會影響作物對硒的吸收，并影響作物對其他礦質元素的吸收，影響作物的產(chǎn)量和品質。胡華鋒等[18]研究表明，噴施硒肥能顯著促進紫花苜蓿對鋅和硒的吸收，并顯著促進磷、銅、錳、硼、鈷和鉬的吸收，且對鋅的吸收能力也與施硒量有關，當硒肥用量超過100 mg·kg-1時，紫花苜蓿對鋅的吸收能力顯著下降，表現(xiàn)為硒對鋅的協(xié)同作用減弱。湯璐等[19]研究表明，硒的施入抑制了菊花(Chrysanthemummorifolium)對銅、鋅元素的吸收，菊花花中的硒含量與硒的施入量之間存在顯著正相關關系。杜倩等[20]研究也證實了硒鋅交互效應與鋅濃度有關，噴施鋅(0.2%～0.4%)對各組分硒含量的提高效應明顯，而高濃度鋅(0.8%～1.2%)抑制了硒的吸收。但在微量元素如硒、鋅含量及其有效性極低的石灰性潮土中關于鋅、硒配施對紫花苜蓿產(chǎn)量及提高紫花苜蓿微量元素含量的報道較少。本研究供試土壤屬于缺硒缺鋅石灰性土壤，不僅含量較低，而且硒、鋅有效態(tài)含量也較低，研究結果表明，通過基施速效態(tài)硒-鋅微肥，可顯著提高紫花苜蓿干草產(chǎn)量及鋅、硒含量；單施硒或硒鋅配施均極顯著提高了苜蓿硒含量，硒鋅間表現(xiàn)為協(xié)同作用；單施鋅極顯著提高了苜蓿鋅含量，配施適量硒促進紫花苜蓿對鋅的吸收，但過量施硒反而不利于苜蓿對鋅的吸收，其具體機理需進一步研究。

3.2 硒、鋅配施對紫花苜蓿氨基酸含量及組成的影響

牧草中氨基酸含量的高低、組成種類以及比例直接影響到牧草最終的品質以及家畜的生長及生產(chǎn)效率。前人主要針對不同牧草品種、牧草隨季節(jié)或牧草不同生育期的氨基酸營養(yǎng)動態(tài)及氨基酸組成進行了研究[6-7]，姜健等[21]對苜蓿各部位氨基酸含量進行了測定，發(fā)現(xiàn)苜蓿莖和葉片中含有18種氨基酸，種子中含有17種氨基酸，同時發(fā)現(xiàn)不同苜蓿品種間、同一品種不同部位間氨基酸含量差異較大。劉龍等[22]以紫花苜蓿葉蛋白為原料，測定了其中的氨基酸組成，其主要為天冬氨酸、甘氨酸、組氨酸、酪氨酸、纈氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和賴氨酸。王照蘭等[5]發(fā)現(xiàn)不同基因型紫花苜蓿氨基酸含量由高到低排列基本相同：為天門冬氨酸>谷氨酸>亮氨酸>脯氨酸；而含量最低的4種氨基酸基本上為胱氨酸<蛋氨酸<組氨酸<酪氨酸，本研究結果與此一致。綜上可以看出，以往的研究均未涉及施肥對牧草氨基酸組成的影響。而且在實際生產(chǎn)中，僅用粗蛋白含量評價飼料的蛋白品質并不能說明該蛋白的“質”與“量”，因為蛋白質中氨基酸含量、組成及比例的不同導致其營養(yǎng)價值有較大差異，最終影響牧草品質及牲畜生產(chǎn)效率[23]。因此，本研究開展了硒、鋅元素配施對紫花苜蓿氨基酸含量及組成的影響，研究結果表明，硒、鋅元素配施各處理紫花苜蓿氨基酸總量以低硒低鋅處理(Se1Zn1)含量最高，為18.89 g·100 g-1，以高硒高鋅處理(Se2Zn2)含量最低，為15.88 g·100 g-1；必需氨基酸含量仍以Se2Zn2最低(5.11 g·100 g-1)，而以低硒高鋅處理(Se1Zn2)最高(6.45 g·100 g-1)，研究結果可以更好地對改善紫花苜蓿氨基酸含量及提高品質提供有效途徑。

3.3 硒、鋅配施對紫花苜蓿氨基酸營養(yǎng)價值的影響

近年來，利用氨基酸的含量及均衡程度評價食品和飼料的營養(yǎng)價值比較廣泛。劉青廣等[24]利用模糊識別法和氨基酸比值系數(shù)法，對紫花苜蓿葉的蛋白營養(yǎng)價值進行了全面的評價，并與4種葉蛋白進行了比較，發(fā)現(xiàn)紫花苜蓿葉中蛋白質的氨基酸種類比較齊全，第一限制性氨基酸為賴氨酸，氨基酸比值系數(shù)分為78.52～85.76。張利平等[17]采用氨基酸評分及氨基酸指數(shù)法，對紫花苜蓿葉芽及其產(chǎn)品中氨基酸的營養(yǎng)進行了分析，結果表明色氨酸是紫花苜蓿芽的第一限制性氨基酸，其評分為56.7%，含硫氨基酸(蛋氨酸+胱氨酸)為第二限制性氨基酸(評分低于100%)。

本研究以FAO/WHO評分模式和雞蛋蛋白的必需氨基酸含量為標準，計算出各處理紫花苜蓿必需氨基酸的AAS值和CS值，結果發(fā)現(xiàn)，施硒明顯降低了其AAS，其中含硫氨基酸(蛋氨酸+胱氨酸)為第一限制性氨基酸，除硫氨基酸(蛋氨酸+胱氨酸)的CS很低外，施硒處理尤其是高硒處理Se1Zn0(84)、Se2Zn0(84)、Se2Zn1(87)、Se2Zn2(81)的CS均低于對照的CS(88)。何金環(huán)等[25]研究結果也發(fā)現(xiàn)聚合草(Symphytumpezegrinum)和紫花苜蓿的第一限制氨基酸均為含硫氨基酸(蛋氨酸+胱氨酸)，AAS分別為47.5和30.0，本試驗的結果與此一致，所不同的是本試驗結果的AAS值更低(16～18)，這可能與不同的土壤條件及硒的施用方法和施用量有關。劉永紅等[6]采用EAAI對阿拉善荒漠草地牧草氨基酸組成特點及營養(yǎng)價值進行了研究，結果表明內(nèi)蒙古白絨山羊限制性氨基酸總含量為0.70%～3.22%；38種牧草的EAAI值，對羊肉為0.914～1.010，對山羊絨為0.976～1.250，對山羊毛為0.951～1.219。本研究也分別以牛肉、兔肉及山羊肉蛋白作為參比得到相似的結果，發(fā)現(xiàn)各處理紫花苜蓿對牛肉的EAAI值為0.885～0.913，對兔肉為0.862～0.889，對山羊肉為0.891～0.919，表明紫花苜蓿對3種動物來說均為優(yōu)良的蛋白飼料。

4 結論

1)在嚴重缺硒和鋅土壤中，硒、鋅配施可顯著提高紫花苜蓿干草產(chǎn)量及鋅、硒含量；單施硒或硒鋅配施均極顯著提高了苜蓿硒含量，硒鋅間表現(xiàn)為協(xié)同作用；單施鋅極顯著提高了苜蓿鋅含量，配施適量硒促進紫花苜蓿對鋅的吸收，但過量施硒反而不利于苜蓿對鋅的吸收。

2)在低硒低鋅的石灰性潮土上基施硒、鋅微肥對紫花苜蓿的氨基酸組成及營養(yǎng)價值影響較大。紫花苜?？偘被岷考氨匦璋被岷孔兓秶謩e為15.88～18.89 g·100 g-1與5.11～6.45 g·100 g-1，均以高硒高鋅處理(Se2Zn2)含量最低，Se2Zn2處理降低了8種氨基酸含量，顯著降低了紫花苜蓿蛋白品質。而Se1Zn0、Se1Zn1、Se1Zn2處理顯著提高了紫花苜蓿必需氨基酸含量及必需氨基酸在總氨基酸中所占的百分率，表明在貧Se地區(qū)施一定濃度的硒肥，既可提高苜蓿產(chǎn)量，又可改善苜蓿品質，鋅肥也有利于苜蓿營養(yǎng)價值的提高。

3)紫花苜蓿蛋白的第一限制氨基酸均為含硫氨基酸(蛋氨酸+胱氨酸)，牧草對牛肉的EAAI值為0.885～0.913，對兔肉為0.862～0.889，對山羊肉為0.891～0.919，因此，紫花苜蓿對3種動物來說均為良好蛋白源。