竹節(jié)參總皂苷對(duì)自然衰老大鼠脂肪組織炎癥的改善作用

劉正泰， 劉朝奇， 何毓敏， 張長(zhǎng)城， 袁 丁， 袁成福

（三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北宜昌 443002）

大量研究顯示[1］，隨著機(jī)體老齡化，脂肪組織從皮下轉(zhuǎn)移到腹部、肌肉、肝臟、骨髓等其他異位位點(diǎn)，其中前脂肪細(xì)胞的分化增殖能力也會(huì)隨著年齡增長(zhǎng)而下降，進(jìn)而釋放出過(guò)多的游離脂肪酸，使機(jī)體處于脂毒性狀態(tài)[2］。功能障礙會(huì)使前脂肪細(xì)胞分泌促炎及趨化因子，招募更多巨噬細(xì)胞，其分泌的細(xì)胞因子進(jìn)一步刺激前脂肪細(xì)胞釋放游離脂肪酸，加劇機(jī)體脂毒性，進(jìn)而誘導(dǎo)并加劇脂肪組織炎癥[3-4］，然后通過(guò)損害正常脂質(zhì)分布、脂肪組織功能等導(dǎo)致脂毒性增加，細(xì)胞應(yīng)激通路激活，進(jìn)而引發(fā)胰島素抵抗等多種脂肪組織系統(tǒng)性功能障礙。因此，深入探討衰老致脂肪組織慢性炎癥及其可能機(jī)制對(duì)老齡化引起的脂肪組織功能障礙及代謝功能障礙具有重要的意義。

竹節(jié)參是五加科人參屬植物竹節(jié)參Panax japnicus C.A.Mey的干燥根莖，其活性成分為竹節(jié)參總皂苷，主要包括竹節(jié)參皂苷Ⅳ、Ⅳa、Ⅴ等[5］，具有降血脂、抗炎等多種藥理活性。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，竹節(jié)參總皂苷具有顯著的抗炎活性[6-10］，但它對(duì)衰老致脂肪組織慢性炎癥的影響尚不明確，故本實(shí)驗(yàn)探討該成分對(duì)自然衰老大鼠脂肪組織炎癥的改善作用。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)SD雄性大鼠購(gòu)自三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，溫度 （22±2）℃，相對(duì)濕度 （60±5）%，光照明暗交替，自由飲食，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào) SCXK（鄂）2011-0061。

1.2 試藥 竹節(jié)參采自湖北省恩施竹節(jié)參種植基地，經(jīng)湖北省天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室專家鑒定為五加科人參屬植物竹節(jié)參Panax japonicas C.A.Mey的干燥根莖，竹節(jié)參總皂苷的分離純化參照課題組前期報(bào)道[11］?？俁NA提取試劑盒 （美國(guó)Thermo公司，批號(hào)139506）；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 （日本TaKaRa公司，批號(hào)AK4401）；PCR引物由生工生物工程 （上海）股份有限公司提供，見(jiàn)表1；βactin抗體 （貨號(hào) 4970 L）、 NF-κΒ 抗體 （貨號(hào) 8242 S）、pNF-κB抗體 （貨號(hào)3033 S） （美國(guó)Cell Signaling公司）；IL-1β抗體 （貨號(hào) ab6671）、 TNF-α抗體 （貨號(hào) ab9722）（美國(guó)Abcam公司）；TLR4抗體 （貨號(hào) SC-293072，美國(guó)Santa Cruz公司）；相應(yīng)二抗 （批號(hào)125510、125435，武漢科瑞有限公司）；ECL顯影劑 （批號(hào)P0018-1，碧云天生物技術(shù)研究所）。其余試劑均為分析純。

表1 PCR引物序列

1.3 儀器 TP1020脫水儀、EG1105H包埋機(jī)、Ultracut-R超薄切片機(jī)、DMR多功能顯微鏡 （德國(guó)Leica公司）；PowerPacTMBasic電泳儀、T100TMThermal Cycler PCR熱循環(huán)儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；Gene Genius凝膠系統(tǒng) （英國(guó)Syngne公司）。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組及給藥 將48只2月齡SPF級(jí)SD大鼠分成自然衰老組及竹節(jié)參總皂苷低、中、高劑量組 （10、30、60 mg／kg），每組12只，待喂養(yǎng)至18月齡后，再取12只2月齡SPF級(jí)SD大鼠同時(shí)喂養(yǎng)4個(gè)月，作為正常對(duì)照組。竹節(jié)參總皂苷組大鼠從18月齡開(kāi)始給藥，至22月齡止，每星期停藥1 d。給藥結(jié)束后，實(shí)驗(yàn)前12 h大鼠禁食不禁水，10%水合氯醛麻醉處死，小心取新鮮附睪脂肪組織，過(guò)液氮，迅速保存于-80℃低溫冰箱中。

2.2 附睪脂肪HE染色 大鼠處死后，切取全部附睪脂肪并稱定質(zhì)量，生理鹽水沖洗，切取厚度適中、呈片狀者，固定、脫水、石蠟包埋后切片，厚度為6 μm。切片經(jīng)脫蠟復(fù)水后，蘇木精染3 min，流水沖30 min，伊紅染30 s，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察并取圖。

2.3 IL-1β、 TNF-α、 MCP-1、 IL-6 mRNA 表達(dá)檢測(cè) 采用RT-PCR法。取附睪脂肪200～300 mg于1.5 mL EP管中，加 150 μL TRIzol研磨至一定程度后補(bǔ)加850 μL TRIzol， 輕輕混勻，冰上靜置5 min，4℃ 12 000 r／min離心10 min；取上清，加三氯甲烷及DEPC水，各占上清體積的1／5，劇烈搖晃15 s，冰上放置 5 min，4℃、12 000 r／min離心15 min，吸取上清無(wú)色溶液，加入等量異丙醇，上下混勻，于-20℃放置15～30 min， 4℃、 12 000 r／min離心10 min，倒掉上清，加入1 mL 75%乙醇，移液槍輕輕吹取沉淀，4℃、7 500 r／min離心5～10 min，吸走上清，室溫下晾干，即得RNA，按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，得cDNA。PCR反應(yīng)體系總體積為10 μL [雙蒸水3.5 μL，PCR Master mix（2x） 5 μL， IL-1β、 TNF-α、 MCP-1、 IL-6、 上下游引物各0.5 μL， cDNA模板0.5 μL］， 以 GAPDH 為內(nèi)參， 擴(kuò)增條件為95℃ 5 min；95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min GOTO2，35次；72℃ 5 min，4℃下低溫保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳后凝膠成像儀拍照取圖，檢測(cè)mRNA表達(dá)，Image-Pro-Plus 6.0軟件進(jìn)行分析。

2.4 IL-1β、 TNF-α、 TLR4、 NF-κB、 pNF-κB 蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blot法。將組織于冰上研磨1～2 min，渦旋后3 000 r／min離心1 min，去除上清液，重復(fù)3次至上清近無(wú)色，去上清，加適量RIPA裂解液、PMSF及磷酸蛋白酶抑制劑A、B（100∶1∶1∶1），組織于冰上研磨1～2 min， 4℃、 12 000 r／min離心15 min， 取上清加入1／5上清體積的蛋白質(zhì)Loading buffer，100℃下煮沸10 min，蛋白樣品于-80℃下保存，電泳分離后轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%牛奶封閉1 h，一抗4℃孵育過(guò)夜，TBST洗滌3次，二抗室溫下孵育 1 h，TBST洗滌 3次，ECL顯色，Image-Pro-Plus 6.0軟件進(jìn)行分析。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過(guò)SPSS 18.0軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)用s）表示，各組樣本間均數(shù)比較采用單因素方差分析，RT-PCR、Western blot數(shù)據(jù)均采用Image-Pro-Plus 6.0軟件進(jìn)行分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 竹節(jié)參總皂苷對(duì)脂肪組織HE染色的影響 圖1顯示，正常對(duì)照組脂肪細(xì)胞排列緊密，大體呈圓形，大小均一；與正常對(duì)照組比較，自然衰老組脂肪細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂、大小不均、排列散亂，巨噬細(xì)胞細(xì)胞浸潤(rùn)顯著增加 （P＜0.05）；與自然衰老組比較，竹節(jié)參總皂苷組可顯著減少衰老致炎性細(xì)胞浸潤(rùn) （P＜0.05），細(xì)胞形態(tài)有所改善。

圖1 各組脂肪組織HE染色 （×200）

3.2 竹節(jié)參總皂苷對(duì) IL-1β、TNF-α、MCP-1、IL-6 mRNA表達(dá)的影響 圖2顯示，與正常對(duì)照組比較，自然衰老組IL-1β、 TNF-α、 MCP-1、 IL-6 mRNA 表達(dá)顯著增加 （P＜0.05）；與自然衰老組比較，竹節(jié)參總皂苷中、高劑量組四者mRNA表達(dá)顯著降低 （P＜0.05）。

3.3 竹節(jié)參總皂苷對(duì)IL-1β、TNF-α蛋白表達(dá)的影響 圖3顯示，與正常對(duì)照組比較，自然衰老組IL-1β、TNF-α蛋白表達(dá)顯著上調(diào) （P＜0.01）；與自然衰老組比較，竹節(jié)參總皂苷組兩者蛋白表達(dá)顯著下調(diào) （P＜0.05）。

3.4 竹節(jié)參總皂苷對(duì)TLR4蛋白表達(dá)的影響 圖4顯示，與正常對(duì)照組比較，自然衰老組TLR4蛋白表達(dá)顯著上升（P＜0.01）；與自然衰老組比較，竹節(jié)參總皂苷組其蛋白表達(dá)顯著下調(diào) （P＜0.05）。

3.5 竹節(jié)參總皂苷對(duì)pNF-κB蛋白表達(dá)的影響 圖5顯示，與正常對(duì)照組比較，自然衰老組pNF-κB蛋白表達(dá)顯著上升 （P＜0.01）；與自然衰老組比較，竹節(jié)參總皂苷組其蛋白表達(dá)顯著降低 （P＜0.05）。

4 討論

衰老一般是生物體隨著時(shí)間的推移，機(jī)體各組織持續(xù)處在慢性、低度的炎癥狀態(tài)，進(jìn)而引發(fā)機(jī)體功能障礙[12］。脂肪組織是人體內(nèi)重要的內(nèi)分泌器官，在年齡相關(guān)的代謝功能障礙和長(zhǎng)壽中起著關(guān)鍵作用[13］，衰老會(huì)促使脂肪細(xì)胞肥大和死亡，這類脂肪細(xì)胞會(huì)招募血液中的單核細(xì)胞浸潤(rùn)至脂肪組織并分化成巨噬細(xì)胞；脂肪組織內(nèi)促炎型巨噬細(xì)胞通過(guò)分泌MCP-1等炎癥因子進(jìn)一步招募巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)至脂肪組織，通過(guò)圍繞并吞噬死亡或垂死的脂肪細(xì)胞形成非常典型的牙套狀結(jié)構(gòu)，這種典型的冠狀結(jié)構(gòu)被用于量化脂肪組織炎癥水平；脂肪組織內(nèi)部固有的巨噬細(xì)胞會(huì)從抑炎型 （M2）向促炎型 （M1）轉(zhuǎn)變，從而加劇脂肪組織慢性炎癥。Lumeng等[14］發(fā)現(xiàn)，在衰老機(jī)體中脂肪組織巨噬細(xì)胞會(huì)從M2型向M1型轉(zhuǎn)變，促炎型巨噬細(xì)胞在衰老大鼠的脂肪組織中聚集，并分泌IL-6、MCP-1等細(xì)胞因子，加劇炎癥反應(yīng)；本實(shí)驗(yàn)經(jīng)HE染色發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組比較，自然衰老組大鼠脂肪組織細(xì)胞排列紊亂，大量出現(xiàn)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)致牙套狀結(jié)構(gòu)；竹節(jié)參總皂苷可明顯改善其病變情況，脂肪組織排列趨近整齊，因巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)所形成的牙套狀結(jié)構(gòu)明顯減少，表明該成分可減少衰老大鼠中的巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，改善細(xì)胞形態(tài)。

圖2 竹節(jié)參總皂苷對(duì) IL-1β、TNF-α、MCP-1、IL-6 mRNA表達(dá)的影響

圖3 竹節(jié)參總皂苷對(duì)IL-1β、TNF-α蛋白表達(dá)的影響

圖4 竹節(jié)參總皂苷對(duì)TLR4蛋白表達(dá)的影響

圖5 竹節(jié)參總皂苷對(duì)pNF-κB蛋白表達(dá)的影響

在衰老過(guò)程中，機(jī)體內(nèi)大量脂肪組織重新分布，從皮下向腹部?jī)?nèi)臟、肝臟、骨骼肌等其他異位位點(diǎn)轉(zhuǎn)移，脂肪在內(nèi)臟等非皮下部位沉積時(shí)，會(huì)引起脂肪組織功能失調(diào)，增加了機(jī)體代謝性炎癥發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[15］。在脂肪細(xì)胞分化及表型維持過(guò)程中，PPARr家族、C／EBPs家族、抗生脂因子抑制劑具有重要作用。研究表明[16］與年輕個(gè)體比較，衰老大鼠C／EBP-α等關(guān)鍵的生脂轉(zhuǎn)錄因子生成顯著減少，CUGBP、TNF-α表達(dá)增多，其中后者可增加前體脂肪細(xì)胞中前者活性和CHOP表達(dá)，而且CHOP還可抑制脂肪形成，上述變化導(dǎo)致衰老個(gè)體中前脂肪細(xì)胞增殖、分化能力降低。功能障礙的前脂肪細(xì)胞使機(jī)體處于游離脂肪酸過(guò)多的脂毒性狀態(tài)，進(jìn)而引發(fā)并加劇脂肪組織慢性炎癥。

課題組前期發(fā)現(xiàn)，竹節(jié)參具有良好的抗炎活性，具有降血脂、改善心血管疾病、抗病毒增強(qiáng)免疫力的作用，并在體內(nèi)外多個(gè)水平予以證實(shí)[6-10］。本實(shí)驗(yàn)顯示，與正常對(duì)照組比較，衰老大鼠脂肪組織IL-6、MCP-1、TNF-α、IL-1β mRNA表達(dá)，以及 TNF-α、IL-1β蛋白表達(dá)顯著升高，其中MCP-1可進(jìn)一步促使血液中單核細(xì)胞浸潤(rùn)至脂肪組織，分化為促炎性巨噬細(xì)胞；TNF-α能作用于TNF-α受體，再次活化 NF-κB通路；IL-6可激活 JNK、ERK1／2，誘導(dǎo)IRS-1 Ser磷酸化，降低IRS-1表達(dá)，引發(fā)胰島素抵抗，從而進(jìn)一步加劇衰老個(gè)體脂肪組織的慢性炎癥，而竹節(jié)參總皂苷干預(yù)后上述炎性因子表達(dá)均顯著下降，并呈劑量依賴性，表明該成分可改善衰老致脂肪組織慢性炎癥。

雖然關(guān)于衰老致脂肪組織慢性炎癥的具體分子機(jī)制尚不明確，但大量研究表明衰老致游離脂肪酸過(guò)多可能激活TLR4／NF-κB炎癥通路，從而引發(fā)或加劇脂肪組織炎癥。Suganami等[17］經(jīng)體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，飽和脂肪酸對(duì)3T3-L1細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理后，脂肪細(xì)胞大量表達(dá)炎性因子，如MCP-1、TNF-α、IL-6；有研究顯示[18］，飽和游離脂肪酸處理TLR4缺失小鼠-異常的脂肪組織產(chǎn)生的游離脂肪酸等內(nèi)源性配體結(jié)合，激活 NF-κB炎癥通路，促使 IL-6、MCP-1、TNF-α、IL-1β等炎癥因子表達(dá)升高。本實(shí)驗(yàn)顯示，衰老大鼠脂肪組織TLR4、pNF-κB蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，表明衰老大鼠脂肪組織中TLR4／NF-κB炎癥通路被激活，而竹節(jié)參總皂苷干預(yù)后兩者蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，表明該成分可抑制TLR4表達(dá)，降低NF-κB磷酸化，從而改善衰老大鼠脂肪組織炎癥。

綜上所述，竹節(jié)參總皂苷對(duì)衰老大鼠脂肪組織損傷有改善作用，其機(jī)制可能與減少脂肪組織巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)及游離脂肪酸致TLR4蛋白表達(dá)、抑制NF-κB通路激活有關(guān)。