不同產地拉薩大黃HPLC指紋圖譜

徐晨陽， 郭明里， 方 芳， 李 寧?， 龔云麒?

（1.云南中醫(yī)學院，云南昆明 650500；2.昆藥集團股份有限公司，云南昆明 650100）

拉薩大黃為蓼科大黃屬植物拉薩大黃Rheum lhasaense A.J.Li et P.K.Hsiao的干燥根及根莖[1-3］， 生于海拔 3 800 ～ 4 600 m 的山坡草地[3］，產于西藏拉薩、林周、曲松。據 《中華藏本草》記載，其屬于亞大黃的一種，亞大黃 （藏語曲匝）是蓼科大黃屬8種植物的根及根莖，具有清腑熱、瀉疫癘、消腫、愈瘡，治腑熱、膽熱、瘟病時疫、腹痛、便秘的作用[4］。研究表明，拉薩大黃有多種活性成分，其中所含有的曲札茋苷、虎杖苷、白藜蘆醇[5］等二苯乙烯類化合物表現出突出的藥理活性。二苯乙烯類化合物具有抗衰老、抗氧化、提高免疫功能、防止動脈硬化、保護肝臟等作用[6-13］。由于藥材受限于產地、栽培方法等因素，其在有效成分含有量、功效、作用上可能存在一定的差異[14-16］。目前，有關拉薩大黃的含有量測定已有報道[17-18］，但指紋圖譜研究較少，僅憑個別化學成分的含有量難以全面地、客觀地評價拉薩大黃的質量，且存在缺乏對共有峰進行定性等問題。本實驗建立拉薩大黃的HPLC指紋圖譜，同時采用對照品對其共有峰進行歸屬，用于全面評價拉薩大黃的質量。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent 1200高效液相色譜儀 （包括在線脫氣機、四元泵、自動進樣器、DAD檢測器）（美國安捷倫公司）；CP225D分析天平、BD221S分析天平 （德國Sartorius公司）；SHB-Ⅲ循壞水式多用真空泵 （鄭州長城科技工貿有限公司）；Milli-Q超純水機 （德國Millipore公司）；5510E-DTH超聲波清洗器 （美國必能信公司）。

1.2 試劑與材料 色譜純乙腈 （德國默克股份兩合公司）、色譜純甲醇 （德國默克股份兩合公司）、磷酸 （分析純）、超純水?；⒄溶諏φ掌?（批號111575-200502）購自中國食品藥品檢定研究院，曲札茋苷 （批號 20120715）、白藜蘆醇 （批號20140920）、去氧土大黃苷 （批號20140623）對照品為昆藥集團股份有限公司藥物研究院自制。

20批拉薩大黃藥材，詳細信息見表1。所有樣品經昆藥集團股份有限公司李寧博士鑒定為正品，標本保存于昆藥集團股份有限公司藥物研究院。

2 方法與結果

2.1 供試品溶液制備 取樣品粉末 （過3號篩）約0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入75%甲醇 50 mL，稱定質量，超聲處理 （功率250 W，頻率35 kHz）30 min，放冷，用75%甲醇補足減失質量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2 對照品溶液制備 精密稱取曲札茋苷、虎杖苷、白藜蘆醇、去氧土大黃苷對照品適量置于棕色量瓶中，用75%甲醇溶解并稀釋配制成每1 mL含0.1 mg的溶液，即為曲札茋苷、虎杖苷、白藜蘆醇、去氧土大黃苷對照品溶液。

2.3 色譜條件 Grace Apollo C18柱 （250 mm×4.6 mm，5 μm）；檢測波長319 nm；柱溫20℃；體積流量1.0 mL／min；流動相乙腈 （A） -水 （含0.1%磷酸，B），梯度洗脫 （0～18 min，15%A；18～30 min， 20%A； 30～45 min， 30%A； 45～50 min， 50%A； 50～55 min， 30%A； 55 min， 15%A）；理論板數按曲札茋苷峰計算應不低于5 000。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，記錄165 min色譜圖，見圖1，主要成分已于55 min內全部流出。因此規(guī)定分析方法為分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，記錄 55 min色譜圖，即得。

圖1 樣品HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of sample

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度試驗 取同一批號樣品 （批號20160130），按 “2.1”項下方法制備供試品溶液，在 “2.3”項條件下連續(xù)進樣6次，測得各色譜峰相對保留時間RSD小于1%和相對峰面積RSD小于3%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 重復性試驗 取同一批號樣品 （批號20160130），按 “2.1”項下方法平行制備供試品溶液6份，在 “2.3”項條件下進樣，測得各色譜峰相對保留時間RSD小于1%和相對峰面積RSD小于3%，表明該方法重復性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗 取同一份批號樣品 （批號20160130），按 “2.1”項下方法制備供試品溶液，在 “2.3” 項條件下，于0、1、2、3、9、22、26、39 h進樣，測得各色譜峰相對保留時間RSD小于1%和相對峰面積RSD小于3%，表明供試品溶液在39 h內穩(wěn)定性良好。

2.5 HPLC指紋圖譜建立

2.5.1 HPLC指紋圖譜 取不同批次拉薩大黃藥材共20批，分別按照已建立的拉薩大黃指紋圖譜分析方法進行分析，得到各批藥材的HPLC指紋圖譜，見圖2。

圖2 20批樣品HPLC指紋圖譜Fig.2 HPLC fingerprints of twenty batches of samples

2.5.2 相似度分析 以20批樣品的色譜指紋圖譜為基礎，使用藥典會推薦的 “中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”2012.130723進行數據處理，見圖3，得到共有模式指紋圖譜。通過比較20批藥材的色譜圖，確定了9個共有峰，見圖4。分別生成20批樣品的共有模式、野生品的共有模式、栽培品的共有模式。

對20批樣品HPLC指紋圖譜進行相似度分析，以20批樣品的共有模式為參照，得所有批次與共有模式的相似度均在0.95以上。野生品平均相似度為0.983，栽培品平均相似度為0.988。

以12批野生樣品的共有模式為參照，分別計算20批藥材的相似度，得所有批次藥材與共有模式的相似度均在0.95以上。野生品平均相似度為0.982，栽培品平均相似度為0.987。

以8批栽培樣品的共有模式為參照，分別計算20批藥材的相似度，得所有批次藥材與共有模式的相似度均在0.90以上。野生品平均相似度為0.971，栽培品平均相似度為0.993。

2.6 相對保留值系統對指紋圖譜評價

2.6.1 內參照峰選擇 拉薩大黃指紋圖譜中的1號峰經與對照品對照，確定為曲札茋苷。該色譜峰與相鄰的色譜峰分離良好，且為各批拉薩大黃藥材中所共有的色譜峰。因此確定其為內參照峰。

圖3 各樣品共有模式圖Fig.3 Common models of various samples

2.6.2 相對保留時間 相對保留時間是色譜指紋圖譜定性的依據，以1號峰的保留時間為標準，其他色譜峰的保留時間與之相比，從而求得各色譜峰的相對保留時間。相對保留時間體系將波動性較大的保留時間轉變成穩(wěn)定性較好的相對保留時間，有助于建立各樣品統一的定性依據。在本研究中，各共有峰標識的保留時間和相對保留時間與20批藥材共有模式相同。

2.6.3 相對峰面積 相對峰面積是色譜指紋圖譜定量的依據。以1號峰的峰面積為標準，其他色譜峰面積與其相比，由此得到一系列的面積比值，這些歸一化面積表達了各樣品所含成分之間量的關系，該數據可用于待測樣品與標準藥材間相似性的量化描述，提高了樣品間的可比性和比較結果的可信性。

本研究對拉薩大黃指紋圖譜中9個共有峰的保留時間、相對保留時間，各色譜峰相對峰面積比值范圍進行了統計計算，見表2。拉薩大黃20批藥材共有峰的相對峰面積分布在一個較寬的范圍內，最大RSD達到158.84%。其中3號和8號峰變化幅度最大，其次為4號、5號和9號峰，7號峰（除1號曲札茋苷色譜峰以外最大的色譜峰）相對穩(wěn)定。相對峰面積的變化客觀反映了化學成分的批間差異。

表2 16批樣品共有峰相對保留時間及相對峰面積Tab.2 The relative retention time and relative peak areas of common peaks of sixteen batches of samples

2.7 共有峰指認 取曲札茋苷、虎杖苷、白藜蘆醇、去氧土大黃苷對照品溶液，按照拉薩大黃藥材指紋圖譜分析方法對照品進樣分析，通過對照保留時間對拉薩大黃指紋對照圖譜中的色譜峰進行指認和標定，鑒定了3個共有峰 （曲札茋苷、虎杖苷、去氧土大黃苷），和1個非共有峰 （白藜蘆醇），見圖4。

2.8 含有量測定 在拉薩大黃指紋圖譜研究的基礎上，以外標一點法對曲札茋苷和去氧土大黃苷進行了含有量測定，見表3。對曲札茋苷，拉薩大黃指紋圖譜的分析方法與拉薩大黃質量標準 （昆藥集團股份有限公司企業(yè)內控標準）中曲札茋苷的含有量測定方法完全一致，可視為定量研究。對于去氧土大黃苷，本研究以指紋圖譜的結果計算去氧土大黃苷的含有量，沒有進行檢測限、定量限、加樣回收率等方法學考察，因此可視為半定量研究。

20批拉薩大黃藥材曲札茋苷的平均含有量為4.36%，其中野生品的平均含有量為4.49%，栽培品的平均含有量為4.15%。20批拉薩大黃藥材去氧土大黃苷的平均含有量為3.13%，其中野生品的平均含有量為3.44%，栽培品的平均含有量為2.68%。

表3 各成分含有量測定結果 （%）Tab.3 Results of content determination of various constituents（%）

圖4 各樣品HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various samples

3 小結

本研究建立了拉薩大黃藥材的指紋圖譜分析方法，對20批拉薩大黃藥材進行了測定。用相似度評價軟件和相對保留值系統對結果進行了分析評價。并對指紋圖譜中的曲札茋苷、虎杖苷、白藜蘆醇、去氧土大黃苷4個色譜峰進行了標定。在此基礎上，對曲札茋苷和去氧土大黃苷進行定量研究。

結果表明，拉薩大黃栽培品和野生品的化學成分相似，具有較好的化學等同性。各成分的具體變化規(guī)律有待更多批次樣品數據的積累與比較。本研究建立的分析方法可為拉薩大黃的綜合質量評價提供參考。