基于HPLC-Q-TOF／MS和GC／MS的香丹注射液化學(xué)成分分析

高 添， 楊凌鑒，2， 盛鑫康， 師白梅， 韓焰青， 賈 璞?， 張亞軍， 王世祥，于 潔， 鄭曉暉?

（1.西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西西安 710069；2.安康學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，陜西安康 725000）

香丹注射液是由丹參水提物與降香飽和芳香水按一定比例配伍精制而成的中藥制劑，屬于國(guó)家基本藥物，具有擴(kuò)張血管和增強(qiáng)冠脈血流量等作用，臨床上常用于治療由血瘀等誘發(fā)的冠心病、心肌缺血及腦血管相關(guān)疾病[1-3］。目前，香丹注射液的化學(xué)成分研究多局限于單一藥材成分或個(gè)別指標(biāo)成分進(jìn)行定性定量檢測(cè)[4-5］，而個(gè)別成分的分析難以闡明制劑的有效成分。因此，全面分析香丹注射液化學(xué)成分輪廓對(duì)于明確制劑的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)具有重要意義。

近年來(lái)，高效液相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（HPLC-Q-TOF／MS） 和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC／MS）等色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)憑借其具有的高分離性、高分辨率以及高靈敏度等優(yōu)勢(shì)，在不需要對(duì)照品的情況下能提供化合物結(jié)構(gòu)表征所需的精確質(zhì)量數(shù)、元素組成、質(zhì)譜碎片等信息，在中藥非揮發(fā)性成分和揮發(fā)性成分的定性檢測(cè)方面得到了日益廣泛地應(yīng)用[6-7］。

本研究首次采用 HPLC-Q-TOF／MS結(jié)合 GC／MS的分析方法對(duì)香丹注射液中化學(xué)成分進(jìn)行定性分析，采用高分辨質(zhì)譜分析結(jié)合對(duì)照品比對(duì)及相關(guān)文獻(xiàn)共鑒定出53個(gè)水溶性化合物，主要為酚酸類、有機(jī)酸類、丹參酮類和氨基酸類等。采用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫(kù)檢索結(jié)合文獻(xiàn)資料參考，共鑒定出9個(gè)揮發(fā)性成分，較為全面地揭示了其化學(xué)組成，以期為香丹注射液的質(zhì)量控制和藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1260 HPLC-6520 Accurate-Mass Q-TOF LC／MS聯(lián)用系統(tǒng)、 Agilent 6890N GC／5973N MSD氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀系統(tǒng) （美國(guó)Agilent公司）；VER-TEX26型快速混勻器 （海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；優(yōu)普UPD-II-10T超純水機(jī)（四川優(yōu)普超純科技有限公司）；XS105DU型電子天平 （瑞士Mettler Toledo公司）；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗儀 （昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥 丹參素鈉 （DSS）、原兒茶酸 （PA）、原兒茶醛 （PAL）、香草酸 （VA）、咖啡酸 （CA）、迷迭香酸 （RA）、丹酚酸B（Sal B）對(duì)照品 （均購(gòu)自于中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)分別為110855-201311、 110809-201205、 110810-200205、110776-200402、 110885-200102、 111871-201203、111562-201212，含有量均大于 98%）；紫草酸（LA）對(duì)照品 （批號(hào) PCM-SM-006，含有量大于98%）購(gòu)自天津萬(wàn)象恒遠(yuǎn)科技有限公司；丹酚酸A（Sal A）對(duì)照品 （批號(hào)為DST160928-009，含有量大于98%）購(gòu)自成都德思特生物技術(shù)有限公司；香丹注射液 （四川升和藥業(yè)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字 Z51021309，批號(hào) 1510203，規(guī)格 10 mL×5支）；上述對(duì)照品與注射劑均于4℃條件下冷藏備用。

色譜純甲醇及乙腈、質(zhì)譜級(jí)甲酸及甲酸銨（美國(guó)Fisher Scientific公司）；超純水 （電阻率為18.25 MΩ）由優(yōu)普UPD-II-10T超純水機(jī)系統(tǒng)制備；其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 色譜-質(zhì)譜聯(lián)用條件

2.1.1 HPLC-Q-TOF／MS 條件 Agilent TC-C18色譜柱 （4.6 mm×250 mm，5 μm）； 流動(dòng)相0.05%甲酸水 （A） -甲醇 （B）， 梯度洗脫 （0～25 min，7% ～15%B； 25～45 min， 15% ～25%B； 45～80 min，25% ～50%B； 80～100 min， 50% ～80%B； 100～115 min， 100%B； 115～120 min， 5%B）； 柱溫30℃；體積流量0.6 mL／min；柱后分流比為3∶1；進(jìn)樣量 20 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源 （ESI）；采用正負(fù)離子2種模式進(jìn)行檢測(cè)；負(fù)離子條件下毛細(xì)管電壓3 500 V；正離子模式下為4 000 V；干燥氣體積流量10 L／min；干燥氣溫度350℃；霧化氣壓力275.8 kPa；碎裂電壓 135 V；掃描范圍 100～1 100 m／z；采樣頻率0.2 s；碰撞能分別設(shè)為10、20、30、40 eV；采集數(shù)據(jù)前利用調(diào)諧液校準(zhǔn)質(zhì)量軸，保證質(zhì)量測(cè)定誤差小于10×10-6。見圖1。

圖1 各樣品總離子流圖Fig.1 Total ion current chromatograms of various samples

2.1.3 GC／MS條件 Agilent HP-5 MS毛細(xì)管色譜柱 （30 m×0.25 mm， 0.25 μm）； 程序升溫， 初始溫度60℃，保持0 min，以1.5℃／min的速率升溫至110℃，保持5 min，再以1.5℃／min的速率升溫至120℃，保持10 min，接著以2℃／min的速率升溫至160℃，保持5 min，最后以20℃／min的速率升溫至260℃，保持0 min；載氣氦氣；體積流量1.5 mL／min； 分流比1∶1； 進(jìn)樣體積1 μL；進(jìn)樣口溫度260℃；氣質(zhì)接口溫度260℃；電離方式電子轟擊 （EI）；電離能量70 eV；掃描范圍m／z 30～600； 掃描間隔0.5 s。

2.2 溶液制備

2.2.1 酚酸混合對(duì)照品溶液制備 精密稱取丹參素鈉、原兒茶酸、原兒茶醛、香草酸、咖啡酸、紫草酸、迷迭香酸酸、丹酚酸B、丹酚酸 A對(duì)照品各5.0 mg，置于5.0 mL的棕色量瓶中，用甲醇定容，得到1.0 mg／mL的各酚酸混合對(duì)照品貯備液。再用甲醇稀釋，得到25 mg／L各酚酸混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液制備

2.2.2 .1 HPLC-Q-TOF／MS供試品溶液 精密量取同一批次香丹注射液1.0 mL，置于5.0 mL量瓶中，用超純水定容，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.2.2 .2 GC／MS供試品溶液 精密量取同一批次的香丹注射液10.0 mL，置于20.0 mL的具塞試管中，用5.0 mL二氯甲烷萃取3次，合并萃取液，經(jīng)無(wú)水硫酸鈉干燥后，將萃取液自然揮發(fā)至約0.5 mL，即得。

3 結(jié)果

3.1 水溶性成分 按 “2.2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在 “2.1.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣，利用質(zhì)譜數(shù)據(jù)獲取各成分結(jié)構(gòu)鑒定所需的母離子及子離子在合理測(cè)定誤差內(nèi)的精確質(zhì)量數(shù)、計(jì)算其元素組成。香丹注射液中水溶性成分在正離子和負(fù)離子模式采集的總離子流圖以及酚酸混合對(duì)照品在負(fù)離子模式采集的TIC圖見圖1。通過對(duì)照品比對(duì)、質(zhì)譜裂解規(guī)律分析和文獻(xiàn)報(bào)道，從香丹注射液水溶性成分中鑒定出53個(gè)化合物，其中包括31個(gè)酚酸、5個(gè)丹參酮、8個(gè)有機(jī)酸、4個(gè)氨基酸、3個(gè)核苷、2個(gè)其他類化合物，見表1。

表1 香丹注射液HPLC-Q-TOF／MS分析Tab.1 HPLC-Q-TOF／MS analysis of Xiangdan Injection

續(xù)表1

3.1.1 酚酸類成分鑒定 在香丹注射液中共檢測(cè)出31個(gè)酚酸類物質(zhì)，其中30個(gè)來(lái)自丹參，1個(gè)來(lái)自降香，該類成分在負(fù)離子模式下響應(yīng)較好。丹酚酸中含有丹參素、原兒茶酸、咖啡酸及其二聚體或多聚體的結(jié)構(gòu)，且二級(jí)質(zhì)譜中常出現(xiàn)丹參素，咖啡酸以及咖啡酰氧基等中性丟失。以化合物36為例，在負(fù)離子模式下，生成了準(zhǔn)分子離子峰m／z 717.14（ [M-H］-）， 子離子 m／z 519.09， m／z 339.05，m／z 321.04， m／z 295.06， 表明母離子 717.14（[M-H］-）分別丟失了一分子丹參素，一分子丹參素加一分子咖啡酸，兩分子丹參素，一分子丹參素加一分子咖啡酸以及一分子二氧化碳。通過對(duì)照品和文獻(xiàn) [24-25］比對(duì)，確定化合物36為丹酚酸B，其二級(jí)質(zhì)譜圖和質(zhì)譜裂解途徑見圖2。

圖2 丹酚酸B質(zhì)譜裂解模式Fig.2 Massspectra and fragmentpathway of salvianolic acid B

3.1.2 有機(jī)酸類成分鑒定 在香丹注射液中共檢測(cè)到8個(gè)有機(jī)酸類成分，均來(lái)源于丹參，該類化合物在負(fù)離子模式下響應(yīng)較好。由于該類化合物中含有羧基基團(tuán)，因此其分子離子峰在裂解過程中存在44 Da（CO2）的中性丟失。以色譜峰4為例，其準(zhǔn)分子離子峰[M-H］-的質(zhì)荷比為m／z 117.019 4，在外加碰撞能量的作用下，該離子又進(jìn)一步碎裂生成[M-H-CO2］-的碎片離子 m／z 73.030 5， 其生成機(jī)制為脫去一分子CO2，根據(jù)文獻(xiàn) [10-11］，將其鑒定為琥珀酸，其二級(jí)質(zhì)譜圖和質(zhì)譜裂解途徑見圖3。

3.1.3 丹參酮類成分鑒定 丹參酮類成分正離子模式下響應(yīng)較好。正離子模式下，共檢測(cè)到5個(gè)該類化合物，均來(lái)自于丹參。以化合物45為例，母離子為m／z 293.080 4（ [M+H］+），由于脫去一分子羥基和一分子羰基，生成了特征性子離子m／z 249.090 6，該子離子繼續(xù)丟失一分子水形成子離子m／z 231.09，根據(jù)文獻(xiàn) [28］，其質(zhì)譜信息與羥基丹參酮I一致，因此，將化合物45歸屬為羥基丹參酮I，其二級(jí)質(zhì)譜圖和質(zhì)譜裂解途徑見圖4。

圖3 琥珀酸質(zhì)譜裂解模式Fig.3 Mass spectra and fragment pathway of succinic acid

圖4 羥基丹參酮I質(zhì)譜裂解模式Fig.4 Massspectra and fragmentpathway of hydroxytanshinoneⅠ

3.1.4 氨基酸類化合物鑒定 通過在質(zhì)譜時(shí)間窗內(nèi)提取離子流圖共發(fā)現(xiàn)4個(gè)物質(zhì)的色譜峰分別為化合物1～3、8，根據(jù)文獻(xiàn) [8-9，15]中檢索化合物的一級(jí)二級(jí)質(zhì)譜信息，確定這4個(gè)物質(zhì)分別為脯氨酸、焦谷氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸，且均來(lái)自于丹參。以化合物1為例，有1個(gè)分子離子峰m／z 116.070 1（[M+H］+），其主要的碎片離子為m／z 70.060 1，其形成機(jī)理是通過母離子丟失一分子甲酸而得到，基于文獻(xiàn) [8］，推測(cè)化合物1為脯氨酸，見圖5。

圖5 脯氨酸質(zhì)譜裂解模式Fig.5 Mass spectra and fragment pathway of proline

3.1.5 核苷類化合物鑒定 化合物5～6質(zhì)子化后得到分子離子峰 [M+H］+，其質(zhì)荷比分別為m／z 245.075 9和268.104 0，進(jìn)一步脫去核糖殘基得到子離子m／z 113.033 2和m／z 136.059 5，根據(jù)已有文獻(xiàn) [12-13］，確定化合物5～6分別為尿苷、腺苷；化合物7首先去質(zhì)子化得到準(zhǔn)分子離子峰m／z 282.084 4（[M-H］-），然后脫去一分子核糖得到m／z 150.043 0 （ [M-H-132］-）， 接著脫去一分子氨 （NH3） 得到碎片離子 m／z 133.013 8[M-H-132-17］-，結(jié)合文獻(xiàn) [14］，推斷化合物7為鳥苷，見圖6。

圖6 鳥苷質(zhì)譜裂解模式Fig.6 Mass spectra and fragment pathway of guanosine

3.2 揮發(fā)性成分 在 “2.1.2”項(xiàng)條件下，對(duì)香丹注射液GC／MS分析供試品溶液進(jìn)行定性分析，獲取香丹注射液揮發(fā)性成分GC／MS總離子流圖，見圖7。將香丹注射液二氯甲烷萃取液總離子流圖中各色譜峰在NIST庫(kù)中進(jìn)行檢索，并與文獻(xiàn)資料進(jìn)行比對(duì)， 確定出香蘭素[22-32］、 橙花叔醇[32-34］、2， 4-二甲基-2， 6-庚二烯醛[32，35］等 9 個(gè)化合物，見表2。

圖7 揮發(fā)性成分GC／MS總離子流圖Fig.7 GC-MS total ion current chromatogram of volatile constituents

表2 揮發(fā)性成分GC／MS分析Tab.2 GC／MS analysis of of volatile constituents

4 討論

4.1 揮發(fā)性成分提取溶劑考察 本研究對(duì)提取溶劑進(jìn)行了考察，分別嘗試了石油醚、二氯甲烷及乙酸乙酯3種溶劑，發(fā)現(xiàn)當(dāng)提取溶劑為二氯甲烷時(shí)，GC／MS中檢測(cè)的色譜峰個(gè)數(shù)較多，且提取過程中不出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，因而采用二氯甲烷作為萃取溶劑。

4.2 條件優(yōu)化

4.2.1 HPLC-Q-TOF／MS條件優(yōu)化 液相色譜條件和質(zhì)譜采集參數(shù)是影響液相色譜-質(zhì)譜高效分離和靈敏檢測(cè)的關(guān)鍵因素[36-38］。在流動(dòng)相選擇方面，由于甲醇表現(xiàn)出與乙腈相似的分離效果且較為廉價(jià)，因而本實(shí)驗(yàn)選擇甲醇作為有機(jī)相；在水相添加劑的選擇方面，本研究分別選取了0.05%甲酸水-甲醇、0.1%甲酸水-甲醇、0.2%甲酸水-甲醇、1 mmol／L甲酸銨-甲醇、 2 mmol／L 甲酸銨-甲醇、5 mmol／L甲酸銨-甲醇等6種不同的流動(dòng)相體系，當(dāng)水相中甲酸的比例為0.05%時(shí)，香丹注射液中各成分的質(zhì)譜響應(yīng)最好，分辨率最佳；在洗脫方式選擇方面，香丹注射液中成分復(fù)雜且部分成分極性十分接近，因而，本研究采用了梯度洗脫的方式；在柱溫選擇方面，當(dāng)柱溫為30℃時(shí)，香丹注射液中各成分分離較好。

在質(zhì)譜采集模式選擇方面，本研究發(fā)現(xiàn)，負(fù)離子模式下香丹注射液中酚酸類、有機(jī)酸等成分的質(zhì)譜響應(yīng)較好，正離子模式下丹參酮類、氨基酸等成分的質(zhì)譜響應(yīng)較好，因而本研究同時(shí)采用正負(fù)離子2種模式對(duì)香丹注射液水溶性成分進(jìn)行檢測(cè)。其次，對(duì)毛細(xì)管電壓、碎裂電壓、霧化氣壓力、干燥氣溫度、干燥氣流速等質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。

4.2.2 GC-MS條件優(yōu)化 溫度是影響GC／MS分離檢測(cè)的重要因素[39］。由于香丹注射液中揮發(fā)性成分較為復(fù)雜，采用恒溫的方式無(wú)法達(dá)到良好效果，且降低了質(zhì)譜檢測(cè)的分辨率，因而本研究采用程序升溫條件，各揮發(fā)性成分的分離和分辨率較好。

4.3 成分分析 近年來(lái)，關(guān)于香丹注射液中水溶性成分的檢測(cè)多集中在丹參素、原兒茶醛、丹參酚酸 B等酚酸類成分，未涉及其他成分的報(bào)道[40］。本研究在前人基礎(chǔ)上，采用HPLC-Q-TOF／MS法對(duì)香丹注射液中的水溶性成分進(jìn)行表征，不僅檢出31個(gè)酚酸，還檢出丹參酮、有機(jī)酸、氨基酸、核苷等其他4類成分共22個(gè)化合物，其中酚酸類化合物占60%，表明丹參酚酸類成分為香丹注射液的主要成分。

在香丹注射液揮發(fā)性成分的GC／MS分析中，共檢出香蘭素、橙花叔醇等9個(gè)化合物，與文獻(xiàn)[22］報(bào)道的成分基本一致，并未檢出文獻(xiàn) [41-43］中報(bào)道的降香揮發(fā)油中氧化石竹烯、沒藥烯、金合歡烯等成分，推測(cè)可能與香丹注射液制劑中降香藥材的來(lái)源以及制劑的加工形式有關(guān)。

本研究建立的 HPLC-Q-TOF／MS和 GC／MS分析方法較為全面地表征了香丹注射液中的化學(xué)成分，不僅完善了香丹注射液的質(zhì)量控制方法，還可為該制劑體內(nèi)藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究奠定基礎(chǔ)。