大孔吸附樹脂分離純化油橄欖葉總黃酮

李 俊， 劉孟源， 方升平， 王維香

（西華大學食品與生物工程學院，四川成都 610039）

油橄欖又名洋橄欖、齊敦果，是以 “高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高效”為特征的世界名貴常綠木本油料和果用樹種[1］，國外學者已從中分離得到100多個化合物，其中油橄欖葉中含有的抗氧化活性成分較果實更突出，主要為多酚類[2-4］。研究表明，油橄欖葉提取物有著降血脂、降血糖、降血壓作用，并且可預防老年癡呆和癌癥，治療膽結石，抑制病毒和細菌[5-7］，同時具有很強的抗氧化活性，可取代化學防腐劑用于食品保鮮[8-11］，國外已將其廣泛用于化妝品、食品和藥品。油橄欖葉多酚類成分的分離提取技術包括有機溶劑萃取[6］、超聲輔助浸提[12-13］、 微波輔助浸提[14］、 超臨界流體萃取[15］、吸附法[16］等，其中吸附法對酚類／多酚類物質(zhì)的分離濃縮有明顯優(yōu)勢[17］。

油橄欖引入我國后受到政府大力扶持，已經(jīng)初具規(guī)模，特別是四川、云南、甘肅等地已經(jīng)出現(xiàn)較具規(guī)模的大型基地，但僅利用了其果實，而大量葉被廢棄，造成資源浪費，目前回收利用該部位葉中的活性成分越來越受到重視[18-21］。因此，本實驗比較9種大孔吸附樹脂對油橄欖葉中總黃酮的吸附、解吸、動力學特性，從中篩選出選擇性好、吸附率高、易解吸的樹脂，同時優(yōu)化其吸附與解吸條件，為提高其質(zhì)量提供指導意義。

1 材料

油橄欖葉采自涼山州會理縣豐達生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司油橄欖種植基地，經(jīng)西華大學食品與生物工程學院楊文宇副教授鑒定為木犀科木犀欖屬常綠喬木油橄欖Olea europaea L.的葉，將其自然晾干粉碎后過100目篩，40℃下干燥至恒定質(zhì)量。UV-2600紫外可見分光光度計 （上海尤尼柯儀器有限公司）；RE-52B真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 （上海亞榮生化儀器廠）；TDL-40B臺式低速離心機 （湖南星科科技儀器有限公司）；ST-02A多功能粉碎機 （永康市帥通工具有限公司）；層析柱 （上海嘉鵬科技有限公司）；BS-100A自動分部收集器、HL-2恒流泵 （上海滬西分析儀器廠）。大孔吸附樹脂基本信息見表1。蘆丁對照品 （上海試劑二廠）；其他試劑均為分析純 （成都市科龍化工試劑廠）。

表1 大孔吸附樹脂基本信息Tab.1 Basic information of macroporous adsorption resins

2 方法

2.1 標準曲線繪制[4］以蘆丁對照品質(zhì)量濃度為橫坐標 （X），吸光度為縱坐標 （A）進行回歸，得到回歸方程為A＝0.735 2X-0.001 9，在0.09～1.075 mg／mL范圍內(nèi)線性關系良好。

2.2 總黃酮質(zhì)量濃度測定 稱取干燥至恒定質(zhì)量的油橄欖葉144.8 g，1 L 70%乙醇在80℃下水浴提取2 h，4 000 r／min離心10 min，收集上清液，同法提取殘渣，合并2次上清液，40℃、50 r／min下濃縮至 870 mL，加入 0.4%殼聚糖醋酸溶液100 mL，過濾，濾液用70%乙醇稀釋至2 180 mL，測定總黃酮質(zhì)量濃度。

2.3 大孔吸附樹脂篩選[22-25］

2.3.1 預處理 非極性樹脂用95%乙醇浸泡24 h，充分溶脹，95%乙醇沖洗至洗出液加適量蒸餾水無白色渾濁，再用雙蒸水洗至無醇味；陰離子交換樹脂用1 mol／L HCl浸泡2～3 h后，蒸餾水洗至近中性，再用1 mol／L NaOH浸泡2～3 h后蒸餾水洗至近中性；D296樹脂依次用丙酮和乙醇浸泡24 h，再用雙蒸水洗至無醇味。

2.3.2 靜態(tài)飽和吸附量測定 稱取預處理后的樹脂各1.000 g，加入 100 mL樣液，室溫下振蕩24 h，于1、2、4、6、8、24 h取1 mL上清液測定總黃酮含有量，計算樹脂對總黃酮的飽和吸附量，公式為飽和吸附量＝ （C0-Ct）Vy／Ws， 其中 C0為吸附前樣品溶液中總黃酮質(zhì)量濃度，Ct為吸附后樣品溶液中總黃酮質(zhì)量濃度，Vy為樣品溶液體積，Ws為樹脂質(zhì)量。

2.3.3 靜態(tài)解吸率測定 將吸附飽和的樹脂置于250 mL錐形瓶中，加入100 mL 70%乙醇振蕩6 h后靜置24 h，取1 mL上清液，測定解吸液中總黃酮含有量，計算樹脂靜態(tài)解吸率，公式為解吸率＝[（CjVj） ／（QWs）]×100%， 其中， Cj為解吸后上清液中總黃酮質(zhì)量濃度，Vj為解吸后上清液體積，Ws為樹脂質(zhì)量，Q為樹脂靜態(tài)飽和吸附量。

2.4 HPD-300型大孔吸附樹脂吸附總黃酮的條件

2.4.1 正交試驗 在預試驗基礎上，選擇總黃酮質(zhì)量濃度 （A）、上樣液體積流量 （B）、上樣液pH值 （C）、洗脫液體積流量 （D）作為影響因素，每個因素3個水平，通過L9（34）表進行設計。因素水平見表2。

表2 因素水平Tab.2 Factors and levels

然后，取25 mL樹脂裝柱，層析柱徑高比1∶10，油橄欖葉提取液上柱量16 BV，70%乙醇洗脫，收集洗脫液，每組200 mL，測定總黃酮含有量，計算樹脂動態(tài)吸附率，公式為吸附率＝[ （C0Vy-CiVi） ／（C0Vy）]×100%， 其中C0為上樣液中總黃酮質(zhì)量濃度，Vy為上樣液體積，Cl為流出液中黃酮質(zhì)量濃度，Vl為流出液體積。

2.4.2 吸附泄漏曲線考察 條件為上柱液總黃酮質(zhì)量濃度3.25 mg／mL，pH值5.0，上柱體積流量2 BV／h，層析柱徑高比 1∶10，收集流出液，1 BV／管，測定每管收集液中總黃酮質(zhì)量濃度，繪制吸附泄漏曲線。

3 結果

3.1 總黃酮質(zhì)量濃度測定 表3顯示，總黃酮平均質(zhì)量濃度為1.945 mg／mL。從144.8 g干燥油橄欖葉中提取分離出的總黃酮質(zhì)量為4.24 g，油橄欖葉中總黃酮得率為2.93%。

表3 總黃酮質(zhì)量濃度測定結果Tab.3 Results of concentration determination of total flavonoids

3.2 大孔吸附樹脂篩選 表4顯示，強極性樹脂D296、S-8對總黃酮的吸附作用較好，但解吸率極低；弱極性樹脂AB-8、S-8雖然有較大的比表面積，但吸附量和解吸率都較低；非極性樹脂LS-8比表面積較小，吸附性能較差；非極性樹脂HPD-300、D140比表面積較大，孔徑較小，對總黃酮的吸附性很強，解吸率也較高，尤其是前者有更大的比表面積，吸附作用更強。另外，總黃酮在強極性樹脂上具有很強的吸附能力，但解吸難，而在非極性或弱極性樹脂上有更好的吸附效果，故本實驗選擇非極性樹脂HPD-300進行后續(xù)研究。

表4 大孔吸附樹脂吸附量、解吸率Tab.4 Adsorption quantities and desorption rates of macroporous adsorption resins

3.3 吸附總黃酮條件

3.3.1 動態(tài)吸附 表5～6顯示，各因素影響程度依次為A＞C＞B＞D，最優(yōu)工藝為A1B3C3D3，即徑高比1∶10，上樣液質(zhì)量濃度3.25 mg／mL，體積流量2 BV／h，pH值5.0，體積16 BV，洗脫液體積流量1 BV／h，總黃酮吸附率最高，為83.5%。另外，低質(zhì)量濃度下總黃酮不利于吸附，當上樣液質(zhì)量濃度為3.25 mg／mL時其吸附率最大，超過該質(zhì)量濃度后反而下降，可能產(chǎn)生泄漏，導致處理量下降。

表5 試驗設計及結果Tab.5 Design and results of tests

表6 方差分析Tab.6 Analysis of variance

3.3.2 吸附泄漏曲線 圖1顯示，上樣液體積在5 BV后開始泄漏，到16 BV時泄漏液中總黃酮質(zhì)量濃度為 3.20 mg／mL，接近上樣液質(zhì)量濃度（3.25 mg／mL），可認為樹脂柱吸附量達到飽和。因此，確定最大上樣液體積為16 BV左右。

圖1 總黃酮吸附泄露曲線Fig.1 Adsorption leakage curve for total flavonoids

3.3.3 吸附洗脫曲線 圖2顯示，洗脫曲線峰型集中，無明顯拖尾現(xiàn)象，總黃酮洗脫集中出現(xiàn)在1～5 BV區(qū)域，以此為富集段，測得總黃酮洗脫率為94%，富集率為346.7%，即是原來的3.47倍。

圖2 總黃酮吸附洗脫曲線Fig.2 Adsorption elution curve for total flavonoids

3.3.4 驗證試驗 采用 “3.3.1”項下最優(yōu)工藝進行3次驗證試驗，結果見表7。由表可知，經(jīng)過樹脂純化后可去除大量雜質(zhì)，從而提高總黃酮量。

表7 驗證試驗結果 （n＝3）Tab.7 Results of verification tests（n＝3）

4 結論

本實驗通過測定9種大孔吸附樹脂對油橄欖葉總黃酮的吸附特性，綜合比較吸附量、解吸率、解吸物中總黃酮質(zhì)量濃度。結果，非極性樹脂HPD-300對總黃酮的分離純化效果最佳，故確定其作為最佳吸附樹脂。最佳純化工藝為樹脂柱徑高比1∶10，總黃酮質(zhì)量濃度 3.25 mg／mL，上樣體積16 BV，體積流量2 BV／h，蒸餾水洗脫3 BV后再用8 BV 70%乙醇洗脫，收集洗脫液，回收乙醇，干燥，此時總黃酮吸附率為83.5%，洗脫率為94%，富集率為346.7%，制得產(chǎn)品中其得率為10.19%，質(zhì)量分數(shù)為87.38%，回收率為80.74%。