氨基酸紙色譜層析法實驗條件優(yōu)化的探索

劉穎沙， 劉小寧， 李國秀， 劉 偉， 時 靜， 孫 進(jìn)， 鐘 陽

(楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院， 陜西 楊凌 712100)

紙色譜法是以濾紙為支持物的層析技術(shù)，濾紙纖維上分布大量的親水性羥基，因此與水親和力強(qiáng)，與有機(jī)溶劑親和力弱，所以在展層時，水是固定相，有機(jī)溶劑是流動相，由于溶質(zhì)在兩相中分配系數(shù)不同，不同的氨基酸隨流動相移動的速率就不同，于是將這些氨基酸分離開來，形成距原點距離不同的色譜點，各物質(zhì)分配系數(shù)相差越大，則越容易分開。樣品被分離后在紙色譜圖譜上的位置，常用比移值Rf(Rf=原點到色譜點中心的距離/原點到溶劑前沿的距離)表示，在一定條件下(如溫度、展開劑的組成、色譜紙質(zhì)量等不變)，某物質(zhì)的Rf是定值，可作為定性分析的依據(jù)。紙色譜分離技術(shù)廣泛應(yīng)用于氨基酸、蛋白質(zhì)、染料、色素和中草藥等物質(zhì)的分離和鑒定，其操作簡便，樣品用量小，既可以用作實驗室的定性分離，也可用于工業(yè)生產(chǎn)產(chǎn)品的分析制備，現(xiàn)已成為生物化學(xué)和生物工程等學(xué)科必不可少的分析工具之一。在農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢測專業(yè)的《食品生物化學(xué)》課程中“氨基酸的紙色譜”是學(xué)生重要的實驗實訓(xùn)內(nèi)容[1]，但是如果按照課本步驟操作：首先，耗時過長，無法在4學(xué)時內(nèi)完成實驗；其次，用微量注射器或者毛細(xì)管進(jìn)行點樣的方式受人為因素干擾，組間結(jié)果差異較大；第三，濾紙易受污染，用濾紙作為惰性支持物容易影響最后分離效果；第四，展開劑展開速度較慢且有刺激性氣味；第五，用噴霧器噴顯色劑(茚三酮溶液)，噴出量和均勻性無法把握，容易污染學(xué)生的實訓(xùn)服。為改善實驗方法，本文對“氨基酸的紙色譜”實驗的固定相、展開劑、點樣方式和顯色方式進(jìn)行優(yōu)化[2-6]。

1 材料與方法

1.1 材料

色譜濾紙(新華一號濾紙)、薄層板、剪刀、層析缸(燒杯500 mL)、培養(yǎng)皿、吹風(fēng)機(jī)、微量注射器(5 uL)或毛細(xì)管、移液槍(5uL)、噴霧器、尺子和鉛筆、鑷子、封口膜。

1.2 試劑

(1)0.5%的氨基酸溶液(亮氨酸、脯氨酸、谷氨酸、纈氨酸)，各種試劑均為分析純。

(2)展開劑(100 mL)。

1號：V(正丁醇)：V(冰醋酸)=4∶1；

2號：V(正丁醇)：V(甲酸)：V(水)=15∶3∶2；

3號：V(正丁醇)：V(冰醋酸)：V(乙醇)：V(水)=4∶1∶1∶2；

4號：V(95%乙醇)：V(水)=7∶3。

1.3 顯色方式

傳統(tǒng)方法，展開完成之后用噴霧器均勻噴上0.1%茚三酮溶液進(jìn)行顯色；改進(jìn)方法,100 mg茚三酮加入配置好的展開劑。

2 實驗步驟

2.1 點樣方式與展開劑的優(yōu)化[7，8]

(1)濾紙。取濾紙1張(22×14 cm)。

(2)點樣。距一端2 cm處用鉛筆輕輕的劃線，然后在線上分別用0.5%的亮氨酸、脯氨酸、谷氨酸和纈氨酸均勻點樣(微量注射器5uL、毛細(xì)管、移液槍5 uL)，重復(fù)3次，每次點樣完后用吹風(fēng)機(jī)冷風(fēng)吹干，每點擴(kuò)散直徑不超過5 mm。將點好樣的濾紙卷成筒狀，使用大頭針縫好(按課本操作步驟用針線縫，常常扯爛濾紙，影響實驗結(jié)果)。

(3)展開[9]。將盛有20 mL展開劑的培養(yǎng)皿迅速置于500 mL的燒杯中，并將點樣筒直立于培養(yǎng)皿中(點樣端在下)，用封口膜封緊燒杯口，待溶液上升至15～18 cm時，取出濾紙，用鉛筆畫出溶劑前沿界線，吹風(fēng)機(jī)冷風(fēng)吹干。

(4)顯色。用噴霧器均勻噴涂0.1%茚三酮溶液(展開劑1、2、3所配茚三酮以正丁醇做溶劑，展開劑4所配茚三酮以乙醇做溶劑)，立即用熱風(fēng)吹風(fēng)機(jī)吹干，即可出現(xiàn)不同位置和顏色的斑點。

(5)Rf值計算。

Rf=原點到色譜點中心的距離/原點到溶劑前沿的距離

2.2 固定相的優(yōu)化[10,11]

(1)薄層板。取薄層板1張(22×14 cm)。

(2)點樣。按照2.1優(yōu)化的最佳點樣方式進(jìn)行點樣。

(3)展開與顯色。在(500 mL)的燒杯中倒入1 cm的展開層，用鑷子將點好樣的薄層板放入燒杯中，點樣端在下，用封口膜封緊燒杯口，待溶液上升至15～18 cm時，取出薄層板。其余步驟與2.1一致。

2.3 顯色方式的優(yōu)化[12,13]

(1)濾紙或薄層板準(zhǔn)備和點樣方式按照2.1和2.2優(yōu)化的步驟。

(2)展開與顯色。展開劑為100 mg茚三酮混合4種展開劑，將點樣筒或板放入展開劑中，用封口膜封緊燒杯口，待溶液上升至15～18 cm時，取出濾紙，用鉛筆標(biāo)記溶劑前沿，吹風(fēng)機(jī)熱風(fēng)吹干。即可出現(xiàn)不同位置和顏色的斑點，用鉛筆描出斑點輪廓。根據(jù)Rf值公式計算各樣品的Rf值。

3 結(jié)果與分析[14,15]

3.1 點樣方式優(yōu)化結(jié)果分析

用微量注射器、毛細(xì)管和移液槍分別點樣現(xiàn)象，以傳統(tǒng)方法進(jìn)行分離(固定相：濾紙；流動相：V(正丁醇)：V(冰醋酸)=4∶1；顯色：0.1%水合茚三酮正丁醇溶液)，微量注射器和毛細(xì)管易戳破濾紙而且點樣圈不均勻，不易操作，移液槍點樣5uL量易于控制且點樣圈大小一致，故采用移液槍進(jìn)行點樣操作。

3.2 固定相優(yōu)化及展開劑優(yōu)化結(jié)果分析

以濾紙和薄層板固定相載體，以四種不同展開劑為流動相，對4種不同類型的氨基酸進(jìn)行分離，兩種固定相及四種不同展開劑均能達(dá)到明顯分離效果，實驗結(jié)果如表1所示。

由表1可知，采用薄層板進(jìn)行層析分離效果優(yōu)于濾紙。Rf值表示溶質(zhì)在支持物上移動的速率，影響Rf值因素很多，主要受物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和極性、支持物、層析所用溶劑、溫度、展開方式、pH及樣品溶液中雜質(zhì)的影響[5]，在進(jìn)行氨基酸分離鑒定時薄層色譜層析法比紙色譜層析法更具有速度快、斑點集中和顯色靈敏等優(yōu)點。

四種不同類型的展開劑均能達(dá)到分離目的。結(jié)合分離效果、時間和試劑毒性，2號展開劑(V(正丁醇)：V(甲酸)：V(水)=15∶3∶2)分離效果較好、分離時間較短且毒性較低； 4號展開劑乙醇易揮發(fā)使展開劑濃度不準(zhǔn)確，展開時間較長，而且展開劑需要臨時配制導(dǎo)致實驗準(zhǔn)備工作繁瑣，故不宜采用。

因此，以薄層板做固定相，以2號展開劑(V(正丁醇)：V(甲酸)：V(水)=15∶3∶2)做流動相，采用移液槍進(jìn)行點樣操作分離效果最佳。

3.3 顯色方式優(yōu)化結(jié)果分析

以薄層板做固定相，采用移液槍進(jìn)行點樣操作，展開劑為100 mg茚三酮混合4種展開劑，對4種不同類型的氨基酸進(jìn)行分離，結(jié)果如表2所示。

由表2可知，采用100 mg茚三酮混合2號展開劑(V(正丁醇)：V(甲酸)：V(水)=15∶3∶2)做流動相，作為新展開劑進(jìn)行分離，分離速度快，效果明顯，顯色靈敏，實驗時間明顯縮短。綜上所述，將茚三酮加入用V(正丁醇)：V(甲酸)：V(水)=15∶3∶2的展開劑中做流動相，以薄層板做固定相，移液槍點樣，實驗過程不需要接觸有毒試劑，實驗時間縮短，實驗結(jié)果明顯。達(dá)到預(yù)期目的。

表1 濾紙和薄層色譜層析實驗結(jié)果對比

表2 薄層色譜層析優(yōu)化結(jié)果