多組織對照體系建立及在免疫組化染色的應(yīng)用

陳培瓊 鐘山 王玉環(huán)

隨著精準(zhǔn)醫(yī)療的來臨，免疫組化已成為病理醫(yī)生重要輔助診斷手段[1]，在病理診斷中的作用日益廣泛。如今，免疫組化技術(shù)不僅用于協(xié)助腫瘤組織學(xué)分類的診斷、腫瘤來源的確定，而且還越來越多的作為判斷預(yù)后及指導(dǎo)臨床個(gè)性化治療的指標(biāo)[2-3]。因此免疫組化染色的可靠性、正確性、穩(wěn)定性至關(guān)重要[4]。免疫組化的染色過程較復(fù)雜，很多因素可對染色結(jié)果產(chǎn)生不同程度的影響。因此，需要建立合格的實(shí)驗(yàn)對照。目前病理科常用的實(shí)驗(yàn)對照有幾種形式：（1）單組織對照；（2）組織芯片對照；（3）“香腸技術(shù)”的多組織對照；（4）樣本中的內(nèi)對照。作者在日常免疫組化染色工作中總結(jié)了上述幾種形式對照的利弊，摸索出了多組織對照方法，并建立多組織對照體系，取得了令人滿意的效果?，F(xiàn)介紹如下。

1 材料與方法

1.1 材料

選取本院各臨床科室送檢的闌尾、結(jié)腸、胰腺、肺、甲狀腺、胎盤、扁桃體、腦、皮膚等組織，10%中性福爾馬林固定，按照常規(guī)組織的脫水，浸蠟和包埋，選取病理診斷明確的剩余的組織蠟塊進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 多組織對照體系的構(gòu)建

結(jié)合日常工作中各抗體使用頻率、組織獲取難易度等因素，多次調(diào)整優(yōu)化組合，設(shè)計(jì)了4組多組織對照體系（見表1），覆蓋面廣，涵蓋多種抗體，以達(dá)到組織耗費(fèi)少、操作簡便、對照效果好的目的。

1.3 多組織對照蠟塊制備前準(zhǔn)備工作

取材蠟塊先經(jīng)過HE染色，鏡下觀察組織形態(tài)，選取部位，例如：肺組織應(yīng)含有正常肺泡結(jié)構(gòu)，扁桃體組織應(yīng)含被覆鱗狀上皮及淋巴小結(jié)等。將HE片上符合要求部位作標(biāo)記，然后比對蠟塊圈出相應(yīng)部位。

1.4 多組織對照蠟塊制備

選取上述經(jīng)過畫圈標(biāo)記的組織蠟塊，放65℃烤箱5分鐘，軟化蠟塊，采用多組織對照點(diǎn)樣器（見圖1A）進(jìn)行取材，該點(diǎn)樣器由作者自行設(shè)計(jì)，不銹鋼定制加工而成。多組織對照點(diǎn)樣器的針頭垂直在蠟塊上加壓，拔出點(diǎn)樣器、用內(nèi)芯推出所取樣組織。所取組織外觀圓形條狀，直徑3 mm。3～5個(gè)組織一起包埋（類似包埋小標(biāo)本），制成多組織對照蠟塊（見圖1B）。

1.5 多組織對照切片制備、染色

對多組織對照蠟塊進(jìn)行連續(xù)地切片，裱于干凈的防脫載玻片上端，標(biāo)明對照體系的類型，將待測組織切片后裱于下端，兩者距離適中。65℃烘烤1 h后上機(jī)，進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。

2 結(jié)果

陽性對照染色理想，不同抗體在不同組織中具有不同定位及染色強(qiáng)度，由于在同一張玻片進(jìn)行所有染色，便于讀片醫(yī)生做出更可靠的判斷。

4組多組織對照體系的建立，經(jīng)多次驗(yàn)證可為我科160多種抗體提供穩(wěn)定可靠的陰陽性組織對照片，基本滿足工作需要。

4組體系基本滿足常用臨床診斷抗體質(zhì)控，每種抗體加了對照片，在日常的質(zhì)控中，就易發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)是否成功，并找出假陰性或假陽性的原因。圖2、圖3（多組織對照免疫組織化學(xué)染色舉例）。

3 討論

為保證病理診斷中免疫組化結(jié)果的可靠性，每種抗體每張切片的染色都應(yīng)進(jìn)行有效的質(zhì)控，設(shè)立穩(wěn)定的對照并合理運(yùn)用是質(zhì)控的關(guān)鍵[5]。免疫組化染色的對照包括陽性組織對照、陰性組織對照、陰性試劑對照、內(nèi)對照[6]。其中，陰性試劑對照是針對內(nèi)源性生物素設(shè)立的，一旦完成試劑最初校驗(yàn)，就可以取消陰性試劑對照[7]。本文所介紹的多組織對照囊括了陽性組織對照、陰性組織對照及內(nèi)對照。內(nèi)對照又包括內(nèi)部陰陽性對照，是每一張被測試的組織切片上都存在的細(xì)胞成份，可確認(rèn)組織固定、包埋步驟的可靠性。在免疫組化染色中使用對照是保證質(zhì)控的最有效的方法[8]。

表1 多組織對照各點(diǎn)組織的抗體陽性表達(dá)對照情況

圖1 1A是多組織對照點(diǎn)樣器 ；1B是多組織對照蠟塊；圖2 2A為扁桃體組織的CD3 細(xì)胞膜陽性（4×10）；2B為扁桃體組織的 Ki67細(xì)胞核陽性（4×10） ；圖3 3A為扁桃體組織的CK5/6 細(xì)胞質(zhì)陽性（4×10）；3B為皮膚組織的P63細(xì)胞核陽性（10×10）

作者發(fā)現(xiàn)單組織對照[8]制作簡單，雖組織獲取方便，但由于標(biāo)記覆蓋面不夠廣，常需要準(zhǔn)備大量用于各種標(biāo)記類型的組織蠟塊，對于不常用的組化，常是醫(yī)生覺得有需要時(shí)提出加對照，技術(shù)員臨時(shí)制作，查片、閱片、找蠟塊耗費(fèi)時(shí)間巨大。并且單組織對照蠟塊常使用已知抗原表達(dá)較強(qiáng)的組織，相對于抗原表達(dá)較弱的檢測組織就容易產(chǎn)生假陰性。組織芯片對照[9]抗體覆蓋面最廣，且高通量，但制作起來需要專門的儀器，對制作過程要求高，包埋易形成空泡，由于組織量小、細(xì)胞數(shù)量少，大量連續(xù)切片陽性率不穩(wěn)定，同一平面常無法切全。平常工作中片子很多，動(dòng)輒上千張，應(yīng)用起來成本巨大，難以推廣到日常，一般用于科研。香腸技術(shù)是運(yùn)用多種組織制作香腸包埋塊陽性對照切片[10]，效果較好，但對照組織面積大，消耗試劑多，要從取材固定開始做起，制作過程煩瑣。

現(xiàn)今，全自動(dòng)免疫組化儀[11]普及，對技術(shù)人員提出更高要求：要為機(jī)器設(shè)定最佳的染色程序。在實(shí)驗(yàn)過程中作者無法觀察到染色的全過程，而此過程中可能出現(xiàn)滴加抗體量不足、混勻不均，沖洗不凈、出現(xiàn)氣泡、溫度下降等現(xiàn)象，會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此作者設(shè)計(jì)了多組織對照點(diǎn)樣器，建立多組織對照體系，制作多組織對照蠟塊，對整個(gè)染色流程及機(jī)器嚴(yán)格精確把控，為病理診斷提供高質(zhì)量的免疫組化染色片，確保染色結(jié)果可靠穩(wěn)定?，F(xiàn)總結(jié)如下：

（1）多組織對照與待測組織在同一張切片上進(jìn)行染色，實(shí)現(xiàn)了實(shí)驗(yàn)條件的一致性，同時(shí)有陰陽性對照，染色結(jié)果可靠、準(zhǔn)確，為免疫組化染色的規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化奠定基礎(chǔ)。切片也可直接歸檔保存，不需要單獨(dú)保存陽性對照切片。

（2）多組織對照分組的設(shè)計(jì)靈活多變，可根據(jù)不同需要設(shè)計(jì)出不同的多組織對照體系。一般選擇三五個(gè)對照組織，兼具抗體覆蓋面和實(shí)際操作，更為方便。 對大量抗體進(jìn)行檢測時(shí)可避免假陰性、假陽性的風(fēng)險(xiǎn)。

（3）用多組織照點(diǎn)樣器取樣，簡便易行。所取蠟塊也是病理診斷明確的剩余組織蠟塊，與待測組織的前處理一致。此外多組織點(diǎn)樣器內(nèi)徑大，所取組織直徑3 mm，大于組織芯片，可提高了取樣的準(zhǔn)確性、便于組織包埋，特別利于腫瘤與正常組織交界處的取樣、方便醫(yī)生閱片。此外通過對多組織對照表達(dá)情況的觀察，可能會(huì)發(fā)現(xiàn)一些抗體在不同組織上的應(yīng)用。

綜上，多組織對照點(diǎn)樣器設(shè)計(jì)簡單，成本低廉，容易操作，經(jīng)過合理設(shè)計(jì)的多組織對照體系耗費(fèi)少、實(shí)用性強(qiáng)、效益性高、可操作性和重復(fù)性好，質(zhì)量可靠穩(wěn)定，可推廣至病理科日常工作中，運(yùn)用于免疫組化染色質(zhì)控中，為室內(nèi)及室間質(zhì)量控制帶來穩(wěn)定、便利，提高了整個(gè)免疫組化染色技術(shù)的質(zhì)控水平。