Beclin-1基因沉默對(duì)蛇六谷提取物損傷胃癌SGC-7901細(xì)胞的影響*

潘 磊，胡夢(mèng)奕，李 賽，陳培豐，尹利明△

(1浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院， 浙江 杭州 310006； 2寧波市中醫(yī)院， 浙江 寧波 315010)

蛇六谷是天南星科魔芋屬的多年生草本植物的統(tǒng)稱(chēng)，又名魔芋，亦稱(chēng)蒟蒻、蒻頭和由跋等。經(jīng)考證[1-2]，浙江地區(qū)藥用“蛇六谷”為花魔芋的塊莖。據(jù)《中藥大辭典》記載，本品性寒，味辛、苦，內(nèi)服有化痰消積、解毒散結(jié)和行瘀止痛的功效，外用可解毒消腫，治療淋巴結(jié)結(jié)核、丹毒、跌打損傷、燙火傷和蛇咬傷等。現(xiàn)代廣泛用于治療各種惡性腫瘤，認(rèn)為其有軟堅(jiān)散結(jié)、清熱解毒抗腫瘤的功效。我們前期篩選并研究發(fā)現(xiàn)蛇六谷提取物(the extract from tuber ofAmorphophalluskonjac，TuAKe)具有抑制胃癌增殖的作用[3]，且能夠誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞發(fā)生自噬[4]，但是機(jī)制并不明確。Beclin-1基因又稱(chēng)BECN1基因，是自噬信號(hào)通路的重要調(diào)節(jié)基因[5]。本研究重點(diǎn)探討beclin-1基因及在蛇六谷提取物抑制人胃癌SGC-7901細(xì)胞活力的作用。

材 料 和 方 法

1 材料

人胃腺癌細(xì)胞株SGC-7901購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。慢病毒載體GV112由上海吉?jiǎng)P生物科技有限公司提供。DMEM 培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco；胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司；CCK-8試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；抗beclin-1和LC3抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology; 凋亡試劑盒購(gòu)自Invitrogen； 抗GAPDH抗體購(gòu)自聯(lián)科生物技術(shù)有限公司。

蛇六谷提取物由浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥物研究所提供，具體操作如下：取蛇六谷飲片100 g，剪成粗顆粒，用8倍體積95%乙醇浸泡過(guò)夜，回流提取2次并負(fù)壓濃縮，2倍體積石油醚萃取2次，再次負(fù)壓濃縮，真空干燥即為蛇六谷石油醚萃取物(蛇六谷提取物)。

2 方法

2.1制備GV112-beclin-1-shRNA慢病毒載體 GV112慢病毒載體購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司。根據(jù)GenBank(NM_003766)中beclin-1基因的已知序列，選擇3個(gè)靶點(diǎn)(256～275、654～673和807～826)，每條模板鏈的組成包括19個(gè)堿基正義鏈和19個(gè)堿基的反義鏈，正反鏈之間有6個(gè)堿基間隔，反義鏈之后有5個(gè)T作為轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)，在模板鏈的兩端加入AgeI和EcoR I酶切位點(diǎn)。2條鏈在退火緩沖液中，90 ℃水浴15 min，冷卻至室溫，通過(guò)T4 DNA ligase 將雙酶切線性化的載體和退火雙鏈DNA連接。經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化和菌落PCR鑒定及測(cè)序，成功制備3個(gè)攜帶beclin-1干擾(beclin-1-RNAi)序列的慢病毒載體; scramble序列為對(duì)照序列。Beclin-1干擾序列見(jiàn)表1。

表1 Beclin-1干擾序列

2.2細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 胃癌SGC-7901細(xì)胞置于含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中， 37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)達(dá)到70%～80%融合，將細(xì)胞分為3組：空白對(duì)照(control,CON)組、陰性對(duì)照組(NC組)和RNAi組(KD組)。取GV112-beclin-1-shRNA1和GV112-NC-shRNA慢病毒顆粒各4 μL，分別轉(zhuǎn)染SGC-7901細(xì)胞，real-time PCR分析內(nèi)源性beclin-1表達(dá)水平(引物序列見(jiàn)表2),計(jì)算敲減效率，最終確定GV112-beclin-1-shRNA1慢病毒載體。收集存活的細(xì)胞并擴(kuò)增培養(yǎng)穩(wěn)定表達(dá)的beclin-1-shRNA及NC-shRNA細(xì)胞。

2.3蛇六谷提取物處理SGC-7901胃癌細(xì)胞 取CON組、NC組和KD組的SGC-7901胃癌細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×108/L，分別加入不同濃度(終濃度為25、50、100和200 mg/L)的蛇六谷提取物進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)。

表2 引物序列及擴(kuò)增條件

2.4CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力 取各組胃癌SGC-7901細(xì)胞，以每孔100 μL接種于96板孔中，細(xì)胞密度為每孔1×104細(xì)胞，復(fù)種于6孔板中。于培養(yǎng)24 h、48 h、72 h、96 h和120 h后，每孔中加入CCK-8試劑10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，充分振蕩，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)的吸光度(A)值，計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞抑制率(%)=(對(duì)照組A值-實(shí)驗(yàn)組A值)/對(duì)照組A值×100%。

2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SGC-7901胃癌細(xì)胞的凋亡率 取胃癌SGC-7901細(xì)胞及beclin-1基因沉默的細(xì)胞株，以每孔3 mL接種于6孔板中，細(xì)胞密度為每孔2×105細(xì)胞，貼璧生長(zhǎng)達(dá)到80%融合，加入不同濃度蛇六谷提取物，培養(yǎng)72 h。收集胰酶消化的貼璧細(xì)胞，冷PBS洗滌細(xì)胞2次，按照凋亡試劑盒說(shuō)明書(shū)，依次加入Annexin V-FITC和PI染料，4 ℃孵育15 min，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，每個(gè)檢測(cè)標(biāo)本記錄 10 000個(gè)細(xì)胞。同樣的實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6Western blot檢測(cè)SGC-7901胃癌細(xì)胞的LC3和beclin-1蛋白的表達(dá) 蛇六谷提取物處理各組SGC-7901胃癌細(xì)胞48 h，采用細(xì)胞裂解液(含50 mmol/L Tris、150 mmol/L NaCl、1% Triton X-100和蛋白酶抑制劑)提取總蛋白。將40 μg蛋白加入SDS凝膠加樣緩沖液20 μL中，煮沸后，經(jīng)SDS-PAGE分離后，將蛋白條帶用電轉(zhuǎn)移到NC膜上，分別加特異性的抗beclin-1和LC3抗體，4 ℃孵育過(guò)夜，加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的 II 抗，經(jīng)充分洗滌后用ECL發(fā)光劑。采用灰度掃描系統(tǒng)測(cè)定并分析目的蛋白條帶。同樣的實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。提取總蛋白并測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。多組均數(shù)比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 敲減beclin-1基因?qū)ξ赴?SGC-7901細(xì)胞beclin-1表達(dá)的影響

將KD和NC組的慢病毒顆粒轉(zhuǎn)染SGC-7901細(xì)胞，NC組慢病毒攜帶scrambled序列，未轉(zhuǎn)染慢病毒的細(xì)胞為空白對(duì)照組(CON組)。KD組(含3個(gè)干擾序列)beclin-1的mRNA 相對(duì)表達(dá)量分別為0.08±0.01、0.16±0.01和0.27±0.01；NC組和CON組beclin-1的mRNA 相對(duì)表達(dá)量分別為1.00±0.01和1.13±0.01。KD組beclin-1的mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量均低于NC組和空白CON組(P<0.01)，3個(gè)干擾序列(KD1、KD2和KD3)的敲減效率分別為91.8%、84.2%和73.0%，KD1序列為最佳干擾序列，見(jiàn)圖1。

Figure 1.The expression of beclin-1 at mRNA and protein levels in the SGC-7901 cells. A: the relative mRNA expression of beclin-1 detected by real-time PCR; B: the relative protein expression of beclin-1 determined by Western blot. Mean±SD.n=3.**P<0.05vsNC group.

圖1Beclin-1的mRNA和蛋白表達(dá)水平的變化

2 蛇六谷提取物抑制胃癌 SGC-7901細(xì)胞的活力

蛇六谷提取物處理胃癌SGC-7901細(xì)胞24 h，A值均低于對(duì)照組(P<0.05或P<0.01)，其中50和100 mg/L組的抑制作用顯著，具有較好的線性關(guān)系，見(jiàn)圖2A；50和100 mg/L蛇六谷提取物分別處理胃癌SGC-7901細(xì)胞5 d，隨作用時(shí)間延長(zhǎng)，A值逐漸減小，呈時(shí)間依賴關(guān)系(P<0.05或P<0.01)，見(jiàn)圖2B。

3 敲減beclin-1基因表達(dá)對(duì)蛇六谷提取物抑制胃癌 SGC-7901細(xì)胞活力的影響

采用慢病毒作為轉(zhuǎn)染載體，將beclin-1-RNAi轉(zhuǎn)染胃癌 SGC-7901細(xì)胞。轉(zhuǎn)染4 d， NC組和KD組的A值均低于CON組(P<0.01)；轉(zhuǎn)染5 d， NC組和KD組的A值亦均低于CON組(P<0.01)。100 mg/L蛇六谷提取物處理KD組細(xì)胞(KD+TuAKe組)，隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)，A值明顯低于KD組(P<0.01)，呈時(shí)間依賴關(guān)系。100 mg/L蛇六谷提取物處理 NC組細(xì)胞(NC+TuAKe組)也可以看到同樣的現(xiàn)象，隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)，A值顯著低于NC組，見(jiàn)圖3。

Figure 2.The effects of TuAKe on the viability of SGC-7901 cells. The TuAKe was incubated with SGC-7901 cells for 24 h (A) and 5 d (B). Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖2蛇六谷提取物抑制SGC-7901細(xì)胞的活力

Figure 3.The effect ofbeclin-1 silencing and TuAKe treatment on the viability of SGC-7901 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsCON group;##P<0.01vsNC group;▲▲P<0.01vsKD group.

圖3沉默beclin-1基因和蛇六谷提取物對(duì)SGC-7901細(xì)胞活力的影響

4 敲減beclin-1基因表達(dá)對(duì)蛇六谷提取物促進(jìn)胃癌 SGC-7901細(xì)胞凋亡的影響

100 mg/L TuAKe處理胃癌SGC-7901細(xì)胞和beclin-1基因沉默的細(xì)胞株， 2 d后流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。CON+TuAKe組、NC+TuAKe組和KD+TuAKe組細(xì)胞的凋亡率分別為13.00%±2.04%、13.58%±1.53%、23.53%±4.58%，分別高于CON組的8.20%±1.20%、NC組的7.40%±1.10%和KD組的16.40%±2.06%(P<0.05)，并且KD組細(xì)胞的凋亡率均高于CON組和NC組(P<0.01)，見(jiàn)圖4。

5 RNAi法敲減beclin-1基因表達(dá)對(duì)SGC-7901胃癌細(xì)胞beclin-1和LC3蛋白表達(dá)的影響

CON+TuAKe組和NC+TuAKe組的beclin-1蛋白均高表達(dá)，分別高于CON組和NC組(P<0.01)，而KD組和KD+TuAKe組的beclin-1蛋白均未檢出；CON+TuAKe組、NC+TuAKe組和KD組的LC3蛋白均高表達(dá)，分別高于CON組和NC組(P<0.01)，而KD+TuAKe組的LC3蛋白表達(dá)低于KD組(P<0.01)，見(jiàn)圖5。

Figure 4.The effect ofbeclin-1 silencing and TuAKe treatment on the apoptosis of SGC-7901 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsCON group;#P<0.05vsNC group;▲P<0.05vsKD group.

圖4沉默beclin-1基因和蛇六谷提取物對(duì)SGC-7901細(xì)胞凋亡率的影響

討 論

臨床研究證明含蛇六谷的中藥方劑在改善腫瘤患者常見(jiàn)癥狀、提高生存質(zhì)量、降低復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移和延長(zhǎng)生存時(shí)間等方面均有較好的療效。我們前期實(shí)驗(yàn)研究顯示石油醚萃取的蛇六谷有效部位具有抑制胃癌細(xì)胞增殖的作用，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)可能通過(guò)誘導(dǎo)自噬發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖的作用，但其機(jī)制尚不清楚。

Beclin-1是自噬的重要調(diào)節(jié)蛋白，與抗凋亡蛋白Bcl-2相互作用，共同調(diào)控自噬[6-8]。前期研究表明蛇六谷提取物能夠下調(diào)Bcl-2表達(dá)，促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡，抑制胃癌細(xì)胞增殖[3-4]。本課題重點(diǎn)研究beclin-1是否參與蛇六谷提取物抑制胃癌細(xì)胞活力。我們預(yù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了beclin-1的mRNA在SGC-7901、MKN-45和BGC-823等多個(gè)胃癌細(xì)胞的表達(dá)水平，結(jié)果顯示beclin-1的mRNA在上述3種細(xì)胞均有表達(dá)，以SGC-7901細(xì)胞表達(dá)為最高。因此，本研究選用以SGC-7901細(xì)胞為靶細(xì)胞。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染beclin-1-RNAi敲減SGC-7901細(xì)胞beclin-1的mRNA和蛋白表達(dá)，導(dǎo)致SGC-7901細(xì)胞活力下降和凋亡率增加,該結(jié)果與楊闖等[9]的報(bào)道基本一致，雖然靶細(xì)胞不同，但沉默beclin-1基因，靶細(xì)胞活力下降。我們推斷，一方面beclin-1在各種細(xì)胞生理活動(dòng)中發(fā)揮重要作用，維持細(xì)胞生長(zhǎng)所必須[8,10]，沉默該基因勢(shì)必影響細(xì)胞生長(zhǎng)，甚至促進(jìn)凋亡[8,10-11]；另一方面，beclin-1基因沉默導(dǎo)致細(xì)胞自噬信號(hào)通路受到抑制，可能阻礙了自噬體與溶酶體的融合，抑制自噬清除活性氧的能力[12]，造成線粒體膜電位不可逆損傷[11]，以及線粒體細(xì)胞色素C的釋放[12]，降低細(xì)胞生長(zhǎng)活力。采用蛇六谷提取物處理SGC-7901細(xì)胞，beclin-1基因敲減和未敲減的細(xì)胞活性均有降低，細(xì)胞凋亡率均有增加，并且beclin-1基因敲減的細(xì)胞活力明顯低于未敲減的細(xì)胞，細(xì)胞凋亡率則明顯高于未敲減的細(xì)胞，提示敲減beclin-1基因表達(dá)促進(jìn)了蛇六谷提取物對(duì)SGC-7901細(xì)胞的抑制作用，在細(xì)胞活力和凋亡方面表現(xiàn)為協(xié)同作用。

Figure 5.The effect ofbeclin-1 silencing and TuAKe treatment on the protein expression of beclin-1 and LC3 in the SGC-7901 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsCON group;##P<0.01vsNC group;▲▲P<0.01vsKD group.

圖5沉默beclin-1基因和蛇六谷提取物對(duì)SGC-7901細(xì)胞beclin-1和LC3蛋白表達(dá)水平的影響

TuAKe上調(diào)SGC-7901細(xì)胞LC3蛋白的表達(dá)，但并未上調(diào)beclin-1基因敲減細(xì)胞LC3蛋白的表達(dá)，表明沉默beclin-1基因能夠部分阻斷TuAKe誘發(fā)的自噬作用。Beclin-1沉默的SGC-7901細(xì)胞LC3蛋白表達(dá)上調(diào)，我們推斷，beclin-1沉默促發(fā)生理?xiàng)l件下細(xì)胞自噬，促進(jìn)LC3表達(dá)[8]；但是能夠抑制誘生性自噬，下調(diào)LC3的表達(dá)[13-14]。沉默beclin-1基因有效抑制了SGC-7901細(xì)胞beclin-1的mRNA和蛋白表達(dá)，部分抑制了自噬通路的活化，但卻加劇了蛇六谷提取物對(duì)該細(xì)胞的損傷作用，其機(jī)制仍不明確，需要進(jìn)一步探討。