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    HSF1基因缺失通過上調(diào)microRNA-195a-3p加速壓力超負(fù)荷下心臟重構(gòu)*

    2019-03-21 10:33:16王時(shí)俊楊繼娥馬雷雷崔兆強(qiáng)鄒云增葛均波
    中國(guó)病理生理雜志 2019年3期
    關(guān)鍵詞:微血管內(nèi)皮細(xì)胞新生

    王時(shí)俊,徐 磊,趙 剛,楊繼娥,馬雷雷,崔兆強(qiáng),鄒云增,葛均波

    (復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院, 上海市心血管病研究所, 上海 200032)

    熱休克反應(yīng)(heat shock response)是普遍存在機(jī)體內(nèi)的一種分子應(yīng)激性防御反應(yīng),一般通過激活細(xì)胞核內(nèi)熱休克轉(zhuǎn)錄因子1(heat shock transcriptional factor 1,HSF1),繼而轉(zhuǎn)錄合成一組熱休克蛋白(heat shock proteins,HSPs),HSPs 具有分子伴侶功能,可參與細(xì)胞內(nèi)多種蛋白質(zhì)的折疊、聚合、轉(zhuǎn)運(yùn)和信號(hào)傳遞等生理作用[1-2]。在我們既往的研究中發(fā)現(xiàn),HSF1過表達(dá)可以顯著減少心肌細(xì)胞凋亡、纖維化和心肌肥厚,而小鼠HSF1基因缺失則會(huì)加重壓力超負(fù)荷下的心臟重構(gòu)[3]。同時(shí),HSF1缺失導(dǎo)致的心肌重構(gòu)并不因HSP70和HSP27等熱休克蛋白過表達(dá)而發(fā)生逆轉(zhuǎn),提示HSF1可能通過HSPs非依賴的調(diào)控機(jī)制,促進(jìn)心肌代謝,細(xì)胞存活和改善心臟重構(gòu)[4]。我們進(jìn)一步的研究證實(shí),HSF1缺失主要導(dǎo)致了心臟的血管新生功能障礙,從而引起機(jī)械應(yīng)力下的心肌細(xì)胞缺血缺氧,加速了細(xì)胞肥大反應(yīng)[3, 5]。然而,HSF1缺失如何導(dǎo)致血管新生障礙,其背后的病理分子機(jī)制還不甚清楚。

    因此,在本研究中我們擬通過HSF1調(diào)控的表觀遺傳學(xué)改變,篩查HSF1敲除前后的微小RNA(microRNA, miR)表達(dá)芯片譜差異,試圖找到在HSF1基因敲除小鼠的心肌組織中明顯上調(diào)的microRNA分子,并探究其與心臟血管新生功能障礙之間的聯(lián)系,闡明HSF1基因缺失加重壓力超負(fù)荷下心臟重構(gòu)的疾病分子機(jī)制,并明確可干預(yù)的分子靶點(diǎn)。

    材 料 和 方 法

    1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

    SPF級(jí)的HSF1基因敲除(knockout, KO;HSF1-/-)小鼠和C57BL/6背景野生型(wild-type, WT)對(duì)照小鼠,雄性,8~10周,20~25 g,飼養(yǎng)于復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,動(dòng)物許可證號(hào)為:SYXK(滬)2016-0006。本實(shí)驗(yàn)所涉及的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)相關(guān)操作和動(dòng)物護(hù)理均依據(jù)美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生研究院發(fā)表的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)和使用準(zhǔn)則(NIH指南發(fā)布:85-23號(hào)出版物,1996修訂)以及復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的相關(guān)規(guī)定。

    2 主要方法

    2.1小鼠壓力超負(fù)荷模型的構(gòu)建 通過主動(dòng)脈弓縮窄(transverse aortic constriction,TAC)方法實(shí)現(xiàn)小鼠心臟的壓力超負(fù)荷。選取8~10 周齡的雄性HSF1-/-小鼠(并以同齡C57BL/6野生型小鼠作對(duì)照),腹腔注射氯胺酮(100 mg/kg)和甲苯噻嗪(5 mg/kg)麻醉小鼠,行氣管插管,并接入呼吸機(jī)(使呼吸頻率保持在110 min-1,潮氣量0.4~0.5 mL),小鼠左側(cè)胸部褪毛后取仰臥位固定于操作板,乙醇消毒后逐層分離皮膚和肌肉,沿胸骨上窩至左第2肋水平撐開5 mm并固定撐開位,分離胸腺暴露主動(dòng)脈弓,將升主動(dòng)脈開口上3 mm處血管與27號(hào)墊針一起結(jié)扎,30 s后拔出墊針,觀察到主動(dòng)脈近心端的波動(dòng)增強(qiáng),逐層縫合并消毒。假手術(shù)只開胸不做主動(dòng)脈弓結(jié)扎。

    2.2小鼠心臟超聲心動(dòng)圖檢查 TAC術(shù)后4周行小鼠心臟超聲檢查。小鼠左側(cè)胸部褪毛,麻醉后仰臥位固定在加熱恒溫的超聲檢查臺(tái)上,并接入呼吸機(jī)。采用30 MHz的高頻探頭(Vevo 770,VisualSo-nics),將M型光標(biāo)的垂直線置于室間隔和左心室后壁乳頭肌水平,輸出M型超聲圖像記錄和心臟功能相關(guān)指標(biāo)。

    2.3心肌組織免疫組化染色 TAC術(shù)后4周,小鼠麻醉處死后心臟取材,用4%多聚甲醛固定,經(jīng)脫水、透明、石蠟包埋后制成切片,切片行HE染色和抗CD31抗體染色(ABC法)[6]。HE染色切片進(jìn)一步用Leica圖像軟件計(jì)算細(xì)胞橫截面積(cross-sectional area, CSA)并作定量分析。

    2.4心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞血管生成實(shí)驗(yàn) 取8~10周齡成年C57BL/6小鼠經(jīng)5%異氟醚麻醉后脫頸處死,分離左心室組織并剪切1 mm×1 mm×1 mm組織塊,滴加1 mL胎牛血清,均勻接種于培養(yǎng)皿(預(yù)先在皿底鋪鼠尾膠,超凈臺(tái)中風(fēng)干過夜),組織塊間隔2 mm,37 ℃含5% CO2培養(yǎng)箱靜置4 h后,追加20%高糖DMEM(改良Eagle培養(yǎng)基),再培養(yǎng)18~24 h后組織塊周圍有細(xì)胞爬出,即原代微血管內(nèi)皮細(xì)胞,利用抗CD31抗體染色鑒定內(nèi)皮細(xì)胞,48~72 h后大量細(xì)胞爬出,去除組織塊后繼續(xù)培養(yǎng)36 h后待細(xì)胞生長(zhǎng)鋪滿培養(yǎng)皿,用0.125%胰酶(含0.02%EDTA)消化細(xì)胞并傳代,進(jìn)行細(xì)胞成管實(shí)驗(yàn)[7]。

    Matrigel(No.356234,BD Biosciences)鋪24孔板底,超凈臺(tái)中風(fēng)干過夜,第2天在板上接種微血管內(nèi)皮細(xì)胞,1%胎牛血清含高糖DMEM,37 ℃、 5% CO2培養(yǎng)箱中孵育18 h后,在顯微鏡下觀察管腔樣結(jié)構(gòu)。計(jì)數(shù)5個(gè)隨機(jī)視野的管腔數(shù)量,并作統(tǒng)計(jì)分析。

    2.5PRKAA2基因3’-UTR功能預(yù)測(cè)和評(píng)價(jià) 首先通過TargetScan6.2生物信息軟件預(yù)測(cè)miR-195a-3p的靶基因,結(jié)合血管新生信號(hào)通路進(jìn)行篩選;從NCBI數(shù)據(jù)庫獲取選定靶基因的小鼠編碼序列,結(jié)合軟件分析其3’-UTR區(qū)域與microRNA互補(bǔ)的序列片段,分別設(shè)計(jì)野生和突變(無義序列)3’-UTR核酸片段,通過亞克隆將2種3’-UTR連接到pMIR-REPORTTM系統(tǒng),采用Luciferase報(bào)告系統(tǒng)對(duì)預(yù)測(cè)位點(diǎn)的實(shí)際結(jié)合能力進(jìn)行測(cè)定。具體步驟為:微血管內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)無血清預(yù)處理后接種于24孔板,通過siPORTTMXP-1轉(zhuǎn)染試劑(AM4507, Applied Biosystems)將上述構(gòu)建的pMIR-WT-3’-UTR和pMIR-Mut-3’-UTR載體(對(duì)照質(zhì)粒)分別轉(zhuǎn)染微血管內(nèi)皮細(xì)胞,轉(zhuǎn)染濃度為100 nmol/L;然后用miR-195a-3p模擬物(mimic)刺激細(xì)胞,細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,采用雙螢光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)(Promega)檢測(cè)熒光強(qiáng)度。將各組的海腎螢光素酶與螢火蟲螢光素酶的相對(duì)比值(Rluc/Luc)與對(duì)照孔的Rluc/Luc(校正為1)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,判斷預(yù)測(cè)的3’-UTR是否為miR-195a-3p的結(jié)合位點(diǎn)。

    2.6RT-PCR和real-time PCR實(shí)驗(yàn) 將左心室心肌組織反復(fù)剪碎后,溶解于1 mL TRIzol(Invitrogen)溶液中并勻漿,然后加入200 μL氯仿,上下混勻30 s后室溫靜置10 min后11 000 r/min離心15 min,取上清加入500 μL的異丙醇,上下輕輕混勻數(shù)次,將樣本置于-20 ℃。30 min后9 000 r/min離心10 min,棄除上清后將EP管中沉淀置于60 ℃烘干箱2 min,加入20 μL 1×TE緩沖液溶解總RNA。然后,按照PrimeScriptTMRT試劑盒(TaKaRa)說明書進(jìn)行RNA逆轉(zhuǎn)錄,再按照SYBR? Premix Ex TaqTMII(TaKaRa)進(jìn)行real-time PCR或普通PCR擴(kuò)增,引物序列見表1。MicroRNA表達(dá)水平用2-ΔΔCt法計(jì)算;心肌肥厚標(biāo)志物心房鈉尿肽(atrial natriuretic peptide, ANP)和β-肌球蛋白重鏈(β-myosin heavy chain, β-MHC)的PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行半定量分析。

    表1 PCR引物序列

    2.7Western blot實(shí)驗(yàn) 選取左心室心肌組織,剪碎后勻漿并裂解于1 mL預(yù)制的RIPA蛋白裂解液中(含50 μL PMSF,蛋白酶抑制劑)。室溫靜置20 min后,采用12 000 r/min高速離心于4 ℃離心 15 min,取上清液每個(gè)蛋白樣本加入含溴酚藍(lán)的6×電泳緩沖液10 μL,95 ℃水浴3 min。取變性后的蛋白樣品30 μL上樣,在10% SDS-PAGE分離2 h,參考蛋白marker的電泳位置截取分離凝膠,將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜(Millipore)。隨后,PVDF膜用5%牛血清白蛋白(BSA)封閉1 h,加入 I 抗(1∶2 000)4 ℃孵育過夜;用1×PBST洗滌PVDF膜3次后加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的II 抗(1∶500)室溫孵育2 h;再用1×PBST洗滌PVDF膜3次后加入高敏ECL顯影液;2 min后在ChemiDocTM化學(xué)發(fā)光成像儀(Bio-Rad)曝光和定量分析免疫條帶。

    2.8MicroRNA芯片篩查 采用華聯(lián)生物提供的microRNA表達(dá)芯片譜篩選HSF1基因缺失對(duì)小鼠心臟microRNA的影響。分別取HSF1-/-小鼠和野生型小鼠左心室組織,利用TRIzol提取總mRNA(如2.5所述);通過microRNA表達(dá)譜芯片篩查,篩選條件為HSF1-/-較野生型對(duì)照表達(dá)閾值>2倍的microRNA分子。對(duì)篩選出的microRNA分子通過RT-qPCR方法,再次驗(yàn)證其在微血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)水平。

    3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示。利用SPSS 17.0軟件對(duì)不同組數(shù)據(jù)分別進(jìn)行平均值比較,兩組間采用非配對(duì)t檢驗(yàn),多組間采用單因素方差分析(one-way ANOVA)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì),并用Tukey檢驗(yàn)校正。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    結(jié) 果

    1 HSF1基因缺失加重壓力超負(fù)荷下的左心室重構(gòu)

    心臟組織HE染色后進(jìn)行CSA分析,結(jié)果顯示TAC術(shù)后4周野生型C57BL/6小鼠的心肌細(xì)胞平均CSA要顯著小于HSF1-/-小鼠(P<0.01),見圖1A。心臟超聲結(jié)果提示,TAC導(dǎo)致野生型小鼠的左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction,LVEF)下降了17.7%(P<0.05);HSF1-/-小鼠的LVEF比野生型小鼠又進(jìn)一步降低10.4%(P<0.05),見圖1B;同時(shí),左室舒張末內(nèi)徑(left ventricular end-dystolic diameter,LVEDD)的擴(kuò)增程度在HSF1-/-小鼠組也更為明顯(P<0.05),見圖1C。心肌肥厚標(biāo)志物的檢測(cè)結(jié)果顯示,β-MHC和ANP在假手術(shù)組間的mRNA表達(dá)沒有差異,TAC致β-MHC和ANP的mRNA表達(dá)水平在HSF1-/-小鼠明顯高于野生型小鼠(P<0.05),見圖1D。同時(shí),心臟組織的免疫組化染色顯示,壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)下野生組CD31表達(dá)要明顯高于HSF1敲除組,而在假手術(shù)情況下2種小鼠的心臟CD31表達(dá)均很低(圖1E),提示壓力超負(fù)荷可以誘導(dǎo)心臟CD31表達(dá)增加,通過血管新生改善心肌肥厚,而HSF1缺失抑制了這種保護(hù)作用。

    Figure 1.HSF1 deficiency promoted pressure overload-induced cardiac hypertrophy. A: HE staining of the myocardial tissues (scale bar=20 μm) and determination of the cross-sectional area (CSA) of cardiomyocytes; B: determination of left ventricular ejection factor (LVEF); C: determination of left ventricular end-diastolic diameter (LVEDD); D: the mRNA levels of β-myosin heavy chain (β-MHC) and atrial natriuretic peptide (ANP) detected by RT-PCR; E: immunohistochemical staining for CD31 in myocardium (scale bar=20 μm). Mean±SEM.n=3.*P<0.05,**P<0.01vssham group;#P<0.05,##P<0.01vsWT group.

    圖1HSF1基因敲除促進(jìn)壓力超負(fù)荷下小鼠心肌肥厚

    2 miR-195a-3p在HSF1敲除小鼠中表達(dá)顯著增高

    通過microRNA表達(dá)譜芯片我們篩到12個(gè)在HSF1-/-小鼠心臟中表達(dá)顯著增高的microRNA,見圖2A。因?yàn)镠SF1參與血管新生信號(hào)通路激活,而血管新生障礙與心臟重構(gòu)密切相關(guān),因此我們進(jìn)一步觀察這些上調(diào)的microRNA與心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的關(guān)系,結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-34a-5p、miR-195a-3p、miR-208b-3p、miR-378a-5p和miR-451a在體外貼塊培養(yǎng)的微血管內(nèi)皮細(xì)胞中有不同程度的表達(dá)升高,而其他microRNA表達(dá)無差異,其中miR-195a-3p的表達(dá)顯著增高(P<0.05),見圖2B。

    Figure 2.Screening for the microRNAs associated with angiogenesis-related signaling pathways which were upregulated in theHSF1 KO mice compared with the WT mice. A: the microRNAs up-regulated more than 2 folds inHSF1 KO mice were depicted by the heat map; B: the microRNAs highly expressed in microvascular endothelial cells were determined in the second-round screening using real-time PCR. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vsWT mice.

    圖2在HSF1基因敲除小鼠模型中篩選與血管新生信號(hào)通路相關(guān)的microRNA

    3 miR-195a-3p過表達(dá)抑制血管新生,促進(jìn)微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡

    血管新生功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)誘導(dǎo)可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞快速生長(zhǎng)和成管;而預(yù)先用miR-195a-3p mimic刺激細(xì)胞, VEGF介導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)受抑,同時(shí)細(xì)胞成管數(shù)目明顯減少(P<0.05),見圖3A,TUNEL染色統(tǒng)計(jì)顯示內(nèi)皮細(xì)胞凋亡數(shù)目較陰性對(duì)照miRNA-NC干預(yù)組有顯著增加(P<0.05),見圖3B。通過Western blot 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)p53蛋白水平在miR-195a-3p mimic預(yù)處理后,較對(duì)照組表達(dá)升高2.24倍(P<0.05),較VEGF預(yù)處理組升高1.68倍(P<0.05);miRNA-NC干預(yù)后,p53的表達(dá)水平與對(duì)照組和VEGF誘導(dǎo)組比較均沒有顯著差異,見圖3C。上述結(jié)果提示miR-195a-3p具有特異性抑制內(nèi)皮細(xì)胞成管和促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的作用。

    4 miR-195a-3p通過抑制 AMPKα2的表達(dá),減少血管新生

    通過生物信息軟件TargetScan 6.2分析可能受miR-195a-3p調(diào)控的靶基因,篩選出預(yù)測(cè)綜合得分排序較高、且涉及血管新生信號(hào)通路的基因——PRKAA2,其編碼蛋白為AMPKα2。雙螢光素酶報(bào)告基因測(cè)定結(jié)果表明,位于AMPKα2基因序列的5736~5757區(qū)域發(fā)生無義突變后,miR-195 mimic抑制AMPKα2轉(zhuǎn)錄的效應(yīng)明顯增強(qiáng),見圖4A。我們進(jìn)一步用Western blot檢測(cè)miR-195 mimic對(duì)于心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的AMPKα2蛋白表達(dá)影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-195 mimic明顯抑制AMPKα2的表達(dá),而miR-NC沒有抑制作用,見圖4B。同時(shí),血管新生因子CD31和VEGF的蛋白表達(dá)水平也被miR-195 mimic顯著抑制,而miR-NC對(duì)于CD31和VEGF的抑制作用不明顯,見圖4C。這些結(jié)果提示miR-195a-3p可能通過抑制AMPKα2的表達(dá),干預(yù)微血管內(nèi)皮細(xì)胞的血管新生。

    討 論

    在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)HSF1基因缺失導(dǎo)致血管再生障礙,加速了TAC誘導(dǎo)下的心肌肥厚向心衰發(fā)展。HSF1缺失的小鼠心臟microRNAs表達(dá)譜與野生型小鼠有明顯差別,其中miR-195a-3p在心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)明顯升高; miR-195a-3p通過3’-UTR靶向抑制AMPKα2,同時(shí)miR-195a-3p過表達(dá)也抑制了心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞的CD31和VEGF的表達(dá)。以上這些發(fā)現(xiàn)提示miR-195a-3p靶向抑制AMPKα2可能是其抑制血管新生的機(jī)制;通過表觀遺傳學(xué)的修飾和調(diào)控,可能是預(yù)防和治療高血壓等壓力超負(fù)荷等應(yīng)激引起心臟重構(gòu)的重要措施。

    Figure 3.miR-195a-3p suppressed the growth and tube formation of microvascular endothelial cells. The cells were stimulated by vascular endothelial growth factor (VEGF) alone, VEGF+miR-195 mimic or VEGF+negative control microRNA (miR-NC). A: the growth and tube formation of the cells were observed, and the numbers for capillary-like tubes were determined; B: the apoptosis of the cells was detected by TUNEL assay; C: the protein expression of p53 was detected by Western blot. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsVEGF group.

    圖3miR-195a-3p促進(jìn)微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和抑制血管再生

    我們課題組既往報(bào)道了HSF1基因缺失會(huì)加重壓力超負(fù)荷下引起的小鼠心肌肥厚和心力衰竭的體征出現(xiàn)[3]。在該研究中,我們主要發(fā)現(xiàn)HSF1過表達(dá)可以抑制壓力超負(fù)荷下心臟p53的增加,并促進(jìn)血管新生因子VEGF和Ang1的表達(dá),而HSF1敲除小鼠會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的血管新生障礙。因此,我們推測(cè)HSF1基因敲除引起的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和血管新生不足可能是促使壓力超負(fù)荷下HSF1-/-小鼠嚴(yán)重缺血缺氧、心肌細(xì)胞肥大、加速心衰的主要原因。但是,HSF1缺失介導(dǎo)心臟血管新生障礙的病理分子機(jī)制仍不清楚。

    在本研究中,我們從表觀遺傳學(xué)的角度分析,HSF1缺失引起的microRNA表達(dá)譜差異造成血管新生障礙的可能性。芯片數(shù)據(jù)提示,HSF1缺失的C57小鼠心臟microRNAs的表達(dá)譜不同于正常對(duì)照小鼠,并且有12個(gè)microRNA分子顯著上調(diào);通過在心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞中進(jìn)一步驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)miR-195a-3p是HSF1缺失后在細(xì)胞中上調(diào)最明顯的分子。miR-195上調(diào)可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖,其機(jī)制是:DNA倍增是促使腫瘤細(xì)胞由G1期快速向S期過渡的關(guān)鍵,而miR-195可以靶向抑制這一細(xì)胞時(shí)期的多個(gè)編碼基因如CCND1、CDK6和EGF2等,從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡[8]。因此,我們認(rèn)為在心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞中的miR-195a-3p表達(dá)增高,可能也是通過調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞中的一些周期基因,造成內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡并影響到內(nèi)皮血管再生功能。通過TargetScan軟件分析,我們確實(shí)找到這些細(xì)胞周期基因可能是miR-195靶點(diǎn)的證據(jù),但是我們找到一個(gè)更為關(guān)鍵的靶基因PRKAA2——AMPKα2的編碼基因。雙螢光素酶報(bào)告基因測(cè)定結(jié)果證實(shí)miR-195a-3p可以作用于PRKAA2基因的3’-UTR區(qū)域。由于AMPKα2在心臟血管新生代謝中發(fā)揮非常重要的作用[9-14],例如,AMPKα2缺失可以抑制下游UCP2、VEGF等蛋白的表達(dá),導(dǎo)致內(nèi)皮功能紊亂和血管新生障礙[9-10];而AMPKα2激活則可以磷酸化eNOS并促進(jìn)VEGF依賴的血管再生和血管舒張[11-12]。此外,AMPKα2激活還可以逆轉(zhuǎn)老化微血管內(nèi)皮細(xì)胞的血管新生功能。在AMPKα2敲除小鼠中,壓力超負(fù)荷可以加重左室肥厚和心功能紊亂[13]。因此,我們推測(cè)miR-195可能不僅僅參與抑制細(xì)胞周期基因,更重要是直接抑制心臟血管新生通路上的關(guān)鍵基因,從而加速了壓力超負(fù)荷下血管新生障礙和心臟重構(gòu)。

    Figure 4.miR-195a-3p inhibited AMPKα2 and angiogenesis-related genes. A: sequence alignment of mouse miR-195a-3p with 3’-UTR of AMPKα2 and the result of dual-luciferase reporter assay; B: the protein level of AMPKα2 was detected by Western blot; C: the expression and quantitative analysis of CD31 and VEGF were performed by Western blot. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vscontrol group.

    圖4miR-195a-3p通過作用于AMPKα2抑制血管新生相關(guān)信號(hào)通路

    在本研究中,我們證實(shí)了miR-195a-3p過表達(dá)不僅有效抑制了心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞中AMPKα2的表達(dá),同時(shí)也抑制了血管新生相關(guān)基因CD31和VEGF的表達(dá),提示miR-195a-3p對(duì)AMPKα2的靶向抑制可能與心臟血管再生功能紊亂有一定關(guān)系。值得注意的是,在本研究中miR-195a-3p的升高與HSF1的缺失有密切關(guān)系。荷蘭學(xué)者van Rooij等[15]在一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn),miR-195心肌特異性高表達(dá)小鼠會(huì)出現(xiàn)快速心衰表現(xiàn),在繁育該品系的小鼠出生第2周后即出現(xiàn)死亡;進(jìn)一步的深入研究確證,在心臟發(fā)育過程中如果miR-195表達(dá)異常增高,可能導(dǎo)致先天性心臟病,包括室上間隔缺損和嚴(yán)重的心室發(fā)育不全等癥狀。而miR-195異常增高引起的這些心臟病理特征,在HSF1敲除小鼠也發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象[3, 16]。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果,提示 HSF1和miR-195存在“cross-talk”或者信號(hào)通路的上下游關(guān)系,而在壓力超負(fù)荷下,HSF1的表達(dá)可以有效抑制機(jī)械應(yīng)力下心臟miR-195a-3p的增加,從而逆轉(zhuǎn)miR-195a-3p對(duì)AMPKα2的抑制,并可能因此激活下游CD31和VEGF等血管新生相關(guān)因子,促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的血管新生能力,改善壓力超負(fù)荷下的心肌重構(gòu)。

    綜上所述,本研究通過構(gòu)建小鼠壓力超負(fù)荷模型,揭示了HSF1基因的缺失可導(dǎo)致心臟miR-195a-3p的表達(dá)異常升高,從而抑制下游AMPKα2的表達(dá),阻滯代償性的血管新生,最終加速了壓力超負(fù)荷下心臟重構(gòu)和心力衰竭的發(fā)生。

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