GDF15和MMP7的表達(dá)與胃癌臨床病理特征及其預(yù)后的相關(guān)性

郭小剛,李 東,黃自鐸

(重慶市黔江中心醫(yī)院普外科,重慶 409000;*通訊作者,E-mail:limao1816@sina.com)

胃癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤,我國(guó)胃癌死亡率占全部惡性腫瘤的23.2%,位于惡性腫瘤死亡率的第一位[1,2]。MMP7又稱基質(zhì)溶解素(matrilysin),基因定位于11號(hào)染色體q21-q22上,編碼267個(gè)氨基酸,是基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)家族成員之一[3]。MMP7蛋白有基質(zhì)降解活性和底物特異性,能夠特異性降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜成分,對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和凋亡等具有調(diào)控作用[4]。MMP7過(guò)表達(dá)加速胃癌細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移[5]。生長(zhǎng)分化因子15(growth differentiation factor 15,GDF15),又稱前列腺衍生因子(prostate-derived factor,PDF),是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factor,TGF-β)超家族成員,基因定位于19號(hào)染色體p13.11上[6]。已經(jīng)有研究報(bào)道GDF15和MMP7可能參與胃癌的發(fā)生發(fā)展[7],但是關(guān)于GDF15、MMP7和胃癌預(yù)后的相關(guān)性研究仍鮮有報(bào)道。本研究即分析GDF15和MMP7蛋白表達(dá)與胃癌臨床病理特征及胃癌患者術(shù)后預(yù)后的相關(guān)性,為探索新的胃癌預(yù)后指標(biāo)以及開發(fā)高效的靶向治療藥物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源

研究所需樣本組織收集自重慶市黔江中心醫(yī)院2014-06～2016-03胃癌術(shù)后標(biāo)本作為研究材料,共106例,其中女性胃癌患者61例,男性胃癌患者45例;平均年齡(58.65±12.57)歲;腫瘤直徑<4 cm 34例,腫塊≥4 cm 72例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移64例,無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移42例;TNM分期:Ⅰ、Ⅱ期48例,Ⅲ、Ⅳ期58例。所有患者術(shù)前均未接受化、放療。本研究經(jīng)過(guò)重慶市黔江中心醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn),獲得所有受試者或者其家屬的書面同意書。

1.2 主要試劑和儀器

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)

1.4 Western blot檢測(cè)胃癌組織和癌旁組織GDF15和MMP7蛋白表達(dá)

樣本研磨后,加蛋白裂解液,置冰上30 min,離心取上清液,測(cè)定蛋白濃度,垂直電泳,室溫下孵育二抗1 h,TBST洗膜3次,每次15 min。ECL顯色3-5 min,在暗室顯影。

1.5 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)胃癌組織和癌旁組織GDF15和MMP7蛋白表達(dá)

用4%福爾馬林對(duì)腫瘤樣本和對(duì)照組織進(jìn)行固定,然后進(jìn)行石蠟包埋,在石蠟切片機(jī)進(jìn)行切片,厚度為5 μm。脫蠟后進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。簡(jiǎn)要步驟如下:100 ℃條件下抗原修復(fù)5 min,PBS洗3次。加10%羊血清室溫封閉30 min。放在搖床上,4 ℃條件下過(guò)夜孵育一抗。37 ℃條件下孵育辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗30 min,室溫下PBS洗3次,每次5 min,雙蒸水洗一次。滴加事先配好的DAB顯色液,光鏡下觀察顯色程度。蘇木素復(fù)染后脫水,中性樹膠封片晾干后觀察拍照。

1.6 免疫組化結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

細(xì)胞染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):無(wú)顯色為0分,呈淺黃色為1分,棕黃色為2分,棕褐色為3分。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):陽(yáng)性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的0%-10%設(shè)為0分,10%-50%設(shè)為1分,50%-80%設(shè)為2分,80%-100%設(shè)為3分。染色強(qiáng)度評(píng)分和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)評(píng)分的乘積≥3者為陽(yáng)性,<3者則為陰性。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn),計(jì)量資料組間差異采用t檢驗(yàn),采用Kaplan-Meier進(jìn)行單因素生存分析。當(dāng)P<0.05時(shí)認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GDF15 mRNA和MMP7 mRNA在胃癌組織和癌旁組織中的表達(dá)

qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與癌旁正常胃組織相比,胃癌組織中GDF15 mRNA和MMP7 mRNA表達(dá)水平均升高(見圖1)。

2.2 GDF15蛋白和MMP7蛋白在胃癌組織與癌旁組織中的表達(dá)

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與癌旁正常胃組織相比,胃癌組織中GDF15蛋白和MMP7蛋白表達(dá)量均增多(見圖2)。對(duì)免疫組織化學(xué)結(jié)果進(jìn)行量化分析,GDF15在胃癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為73.58%,明顯高于癌旁正常胃組織表達(dá)率(26.32%),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=44.80,P=0.000 1,見圖3,表1)。胃癌組織中MMP7表達(dá)陽(yáng)性率為78.30%,明顯高于癌旁正常胃組織表達(dá)率(46.32%),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=22.03,P=0.000 1,見圖3,表1)。

2.3 胃癌組織中GDF15蛋白和MMP7蛋白的表達(dá)與相關(guān)臨床參數(shù)的關(guān)系

GDF15蛋白與腫瘤直徑有關(guān)(χ2=5.527,P=0.019),與年齡、性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期無(wú)關(guān)。MMP7蛋白和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(χ2=8.043,P=0.005)和TNM分期(χ2=9.717,P=0.002)有關(guān)系,與年齡、性別和腫瘤直徑無(wú)關(guān)(P>0.05,見表2)。

2.4 胃癌組織中GDF15和MMP7蛋白表達(dá)與胃癌患者預(yù)后相關(guān)性

Kaplan-Meier生存曲線分析顯示,GDF15陰性胃癌患者生存率比GDF15陽(yáng)性胃癌患者更高(χ2=6.531,P<0.01,見圖4A),MMP7陰性胃癌患者生存率大于陽(yáng)性胃癌患者(χ2=4.278,P<0.05,見圖4B)。

與癌旁組織比較,*P<0.05,**P<0.01圖1 GDF15 mRNA和MMP7 mRNA在胃癌組織和癌旁組織中的表達(dá)水平Figure 1 The expression levels of GDF15 mRNA and MMP7 mRNA in gastric carcinoma tissues and paired adjacent tissues

與癌旁組織比較,*P<0.05,**P<0.01圖2 Western blot檢測(cè)GDF15蛋白和MMP7蛋白在胃癌組織和癌旁組織中的表達(dá)水平Figure 2 The expression levels of GDF15 protein and MMP7 protein in gastric carcinoma tissues and paired adjacent tissues byWestern blot

圖3 GDF15蛋白和MMP7蛋白在胃癌組織和癌旁組織中表達(dá)的SP染色 (×200)Figure 3 The expression levels of GDF15 protein and MMP7 protein in gastric carcinoma tissues and paired adjacent tissues by SP (×200)

表1GDF15和MMP7在胃癌和癌旁正常組織陽(yáng)性表達(dá)率的比較例(%)

Table1ComparisonofpositiveexpressionrateofGDF15andMMP7betweengastriccancertissueandnormaltissueadjacenttocarcinomacases(%)

組別nGDF15MMP7陰性陽(yáng)性χ2P陰性陽(yáng)性χ2P 胃癌組織10628(26.42)78(73.58)5.8040.00023(21.70)83(78.30)5.0530.000 癌旁組織9570(73.68)25(26.32)51(53.68)44(46.32)

3 討論

胃癌是死亡率非常高的惡性腫瘤,術(shù)后復(fù)發(fā)以及化療副作用使胃癌患者預(yù)后較差,尤其是晚期胃癌患者平均生存期還不到一年[8]。因此,研究胃癌發(fā)病的具體分子機(jī)制,鑒定胃癌早期診斷和理想的預(yù)后標(biāo)志物,篩選高效藥物治療靶點(diǎn),對(duì)提高胃癌患者的生存率有重要意義。生長(zhǎng)分化因子15(growth differentiation factor-15,GDF15)作為轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β超家族中的一員,在人體組織中廣泛表達(dá)。GDF15可被多種因素誘導(dǎo)表達(dá),通過(guò)SMAD通路和非SMAD通路發(fā)揮作用[9]。在不同微環(huán)境下,GDF15對(duì)于血管生成有關(guān)鍵作用。GDF15與基質(zhì)金屬蛋白酶7(matrix metalloproteinase 7,MMP7)對(duì)腫瘤血管生成均有調(diào)控作用[10],故選擇這兩個(gè)分子進(jìn)行研究。

表2胃癌組織中GDF15和MMP7的表達(dá)與相關(guān)臨床病理參數(shù)的關(guān)系例(%)

Table2AssociationbetweentheexpressionofGDF15andMMP7ingastriccarcinomatissuesandclinicopathologicalparameterscases(%)

病理參數(shù)nGDF15MMP7陰性陽(yáng)性χ2P陰性陽(yáng)性χ2P年齡 0.10170.7500.5650.452 <60歲3911(28.21)28(71.79)10(25.64)29(74.36) ≥60歲6717(25.37)50(74.63)13(19.40)54(80.60)性別1.925 0.1650.1330.716 男4515(33.33)30(66.67)9(0.20)36(0.80) 女6113(21.31)48(78.69)14(22.95)47(77.05)腫瘤直徑5.527 0.0193.3450.067 <4 cm34 4(11.76)30(88.24)11(32.35)23(67.65) ≥4 cm7224(33.33)48(66.67)12(16.67)60(83.33)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移0.509 0.4768.0430.005 有6421(32.81)43(67.19) 8(12.50)56(87.50) 無(wú)4227(64.29)15(35.71)15(35.71)27(64.29)TNM分期0.090 0.7649.7170.002 Ⅰ、Ⅱ期4812(0.25) 36(0.75) 17(35.42)31(64.58) Ⅲ、Ⅳ期5816(27.59)42(72.41) 6(10.34)52(89.66)

圖4 胃癌組織中GDF15和MMP7蛋白表達(dá)與患者總生存期的關(guān)系Figure 4 Relationship between the expression of GDF15 and MMP7 in gastric carcinoma tissues and overall survival of gastric cancer patients

GDF15被發(fā)現(xiàn)在多種癌癥的腫瘤組織中高表達(dá),轉(zhuǎn)錄生長(zhǎng)因子受體2介導(dǎo)的信號(hào)途徑能夠調(diào)控GDF-15的表達(dá)。在直腸癌的研究中,發(fā)現(xiàn)GDF15通過(guò)綁定TGF-β受體激活Smad2和Smad3信號(hào)途徑,促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和腫瘤轉(zhuǎn)移。胃癌患者血漿和血清中GDF15水平比健康對(duì)照明顯升高,并且血漿中升高的GDF15水平與胃癌病人較差的預(yù)后相關(guān)[11,12]。Ishige等[13]研究發(fā)現(xiàn),GDF15在胃癌組織高表達(dá),胃癌患者血清GDF15水平顯著高于健康對(duì)照和胃炎患者,并與壁浸潤(rùn)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。GDF15還能促進(jìn)成纖維母細(xì)胞激活。GDF15蛋白在胃癌組織的表達(dá)以及與胃癌患者預(yù)后的相關(guān)性仍不明確。與既往報(bào)道結(jié)果一樣,本研究發(fā)現(xiàn)胃癌組織GDF15 mRNA和蛋白表達(dá)水平比癌旁正常組織明顯升高,GDF15在胃癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于癌旁正常胃組織。重要的是,本次研究最新發(fā)現(xiàn),GDF15蛋白陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤直徑大小相關(guān),GDF15陰性胃癌患者生存率比GDF15陽(yáng)性胃癌患者更高。

既往研究表明,胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移與腫瘤細(xì)胞遷徙、黏附關(guān)系緊密,并且細(xì)胞外基質(zhì)降解、腫瘤血管生成在胃癌的侵襲、轉(zhuǎn)移過(guò)程具有重要作用[14,15]。腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵是穿透宿主組織,該過(guò)程涉及到細(xì)胞外基質(zhì)的破壞。在胃癌細(xì)胞,MMP7能夠特異性降解腫瘤細(xì)胞外生理與病理性基質(zhì)的降解和基底膜成分,從而促進(jìn)胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移[16]。Sentani等[17]發(fā)現(xiàn),胃癌組織中MMP7蛋白的表達(dá)水平明顯高于癌旁正常組織,并且MMP7強(qiáng)陽(yáng)性的胃癌患者表現(xiàn)出較強(qiáng)的浸潤(rùn)胃壁及淋巴管、血管滲透能力。異檸檬酸脫氫酶2(isocitrate dehydrogenase 2)通過(guò)核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB(nuclear factor κB)信號(hào)途徑抑制MMP7表達(dá),從而抑制胃癌細(xì)胞的侵襲能力[18]。研究證明,抑制表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)信號(hào)通路后,MMP7蛋白表達(dá)下調(diào),胃癌轉(zhuǎn)移能力下降[19]。MMP7是Wnt/β-cat信號(hào)通路的下游靶基因,受Wnt/β-catenin信號(hào)通路調(diào)控的MMP7進(jìn)一步參與到基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)分解過(guò)程,最終造成腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移[20]。本研究顯示,胃癌組織中MMP7蛋白高表達(dá),并且與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期相關(guān),說(shuō)明MMP7和胃癌侵襲性具有直接關(guān)系。重要的是,Kaplan-Meier生存曲線分析顯示,MMP7陰性胃癌患者生存率大于陽(yáng)性胃癌患者。

綜上所述,GDF15和MMP7是影響胃癌患者術(shù)后生存的危險(xiǎn)因素,可以作為評(píng)估胃癌患者預(yù)后良好與否的參考指標(biāo)。GDF15和MMP7可能成為新的胃癌治療靶點(diǎn)。