基于環(huán)糊精自組裝的納米藥物與基因載體研究進(jìn)展

鄭姣妮，廖榮強(qiáng),，楊 波

(1. 重慶市急救醫(yī)療中心 重慶大學(xué)附屬中心醫(yī)院 重慶市第四人民醫(yī)院藥劑科，重慶 400014)(2. 昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650500)

1 前 言

2016年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)授予了Jean-Pierre Sauvage，J Fraser Stoddart以及Bernard L Feringa，以表彰3位科學(xué)家對(duì)“納米分子機(jī)器的設(shè)計(jì)與合成”做出的卓越貢獻(xiàn)[1]。從長遠(yuǎn)的眼光看，隨著精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的開展，分子機(jī)器很有可能會(huì)在納米醫(yī)學(xué)領(lǐng)域大顯身手，并同時(shí)有望把腫瘤等相關(guān)疾病的治療帶入一個(gè)全新的維度。近年來，在構(gòu)筑“納米分子機(jī)器”技術(shù)方面取得了一系列的創(chuàng)新性突破，利用這些技術(shù)可以更加快捷、方便、靈活地構(gòu)建各種納米藥物與基因載體。超分子非共價(jià)鍵自組裝技術(shù)長期以來一直是納米生物技術(shù)的研究熱點(diǎn)之一。利用非共價(jià)鍵自組裝的特點(diǎn)可以構(gòu)筑出具有新型結(jié)構(gòu)與功能的超分子組裝體，這對(duì)于探索和設(shè)計(jì)具有新型功能的納米藥物與基因載體具有重要意義。

自組裝(self-assembly)是指無序分子之間在無需外力干預(yù)和控制下，能自發(fā)聚集、組織成有序結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象[2]。小分子通過自組裝可以成功構(gòu)建為納米結(jié)構(gòu)材料[3]。利用自組裝方法構(gòu)筑高度有序與低缺陷的納米結(jié)構(gòu)材料是一種極具應(yīng)用前景的制造技術(shù)，已被廣泛應(yīng)用于形貌各異的納米結(jié)構(gòu)材料的構(gòu)建[4]。通過自組裝形成的納米結(jié)構(gòu)材料具有獨(dú)特的物理和化學(xué)性能，可應(yīng)用于納米藥物與基因載體。然而，自組裝通常是自發(fā)的熱力學(xué)過程，難以人為干預(yù)和控制，因此該類納米材料的尺寸與功能調(diào)控仍是一種挑戰(zhàn)[5]。

自組裝納米結(jié)構(gòu)材料的形成主要是小分子砌塊在非共價(jià)鍵相互作用下自發(fā)組織或聚集的結(jié)果，其中的非共價(jià)鍵相互作用主要包括疏水相互作用、氫鍵以及范德華力等[6]。分子識(shí)別(molecular recognition)是自組裝的前提步驟，分子與分子之間若無法完成識(shí)別過程,就無法進(jìn)行下一步的自組裝行為[7]。分子識(shí)別是指某一特定的受體分子選擇性地接納特定形狀大小的配體分子的過程，在此過程中分子相互之間能尋找出最安定、最接近的部位，并組裝出超越單個(gè)分子性能的高次結(jié)構(gòu)聚集體[8]?？偟膩碚f，自組裝手段可以方便、靈活、快捷地將不同功能的生物材料整合到一體，這是很難通過普通化學(xué)手段合成的。因此，通過分子識(shí)別與自組裝構(gòu)筑的納米功能材料往往具有多種物理與化學(xué)性能。

環(huán)糊精(cyclodextrin, CD)是由D-吡喃葡萄糖單元通過α-1,4-糖苷鍵連接構(gòu)成的中空的截錐狀化合物，截錐表面具有親水性，截錐內(nèi)部具有疏水性，其中α-、β-和γ-CD環(huán)糊精最為常見，它們分別由6、7和8個(gè)葡萄糖單元組成，圖1給出了環(huán)糊精的立體結(jié)構(gòu)示意圖[9]。環(huán)糊精主客體包合技術(shù)已被廣泛用于制藥技術(shù)領(lǐng)域。最近幾年，通過環(huán)糊精自組裝構(gòu)筑的具有不同性質(zhì)和形貌的納米藥物與基因載體已經(jīng)大量涌現(xiàn)。該類載體能提高藥物生物利用度、降低毒副作用。例如，Davis等[10]首次報(bào)道了通過陽離子基團(tuán)耦合環(huán)糊精組建陽離子低聚物，且該低聚物能成功與siRNA組合形成非病毒基因載體，目前已在Ⅰ期臨床試驗(yàn)中治療人類黑色素瘤[10]。該團(tuán)隊(duì)還構(gòu)筑了環(huán)糊精-聚乙二醇共聚物，同時(shí)在該共聚物上共價(jià)接枝了喜樹堿，形成載有喜樹堿的納米藥物(CRLX101)，該藥物目前正在進(jìn)行Ⅱ期臨床試驗(yàn)[11]。此外，環(huán)糊精還具有降低膽固醇的作用，可用于心血管疾病的治療[12]，基于環(huán)糊精的納米藥物與基因載體臨床試驗(yàn)如表1。

本文基于作者課題組對(duì)環(huán)糊精的基礎(chǔ)研究，總結(jié)了近年來國內(nèi)外利用環(huán)糊精構(gòu)筑的納米藥物與基因載體的研究進(jìn)展，并對(duì)它們的潛在應(yīng)用價(jià)值進(jìn)行了簡單討論。

圖1 環(huán)糊精的立體結(jié)構(gòu)示意圖[9]Fig.1 Schematic of the spatial structure of cyclodextrin[9]

DrugDiseasePhaseStatusClinical IDStart date-Last updated dateCRLX101 aSolid TumorPhaseⅠ/ⅡCompletedNCT00333502May 2006-Apr 2017Not ProvidedCompletedNCT01612546Nov 2012-Jun 2015PhaseⅡTerminatedNCT01803269Jan 2013-Jun 2016PhaseⅠ/ⅡRecruitingNCT02769962May 2016-Jun 2017CALAA-01 bSolid TumorPhaseⅠTerminatedNCT00689065May 2008- Oct 2013ObesityNot ProvidedCompletedNCT00682916May 2008-May 2017CyclodextrinsSphingolipidosisPhaseⅠCompletedNCT01747135Jan 2013-Apr 2017PhaseⅡ/ⅢRecruitingNCT02534844Sep 2015-Jan 2017Cardiovascular diseasePhaseⅡCompletedNCT01131299Mar 2010-Oct 2016

Note: a. CRLX101 consists of a sugar molecule cyclodextrin linked to a chemotherapy drug called camptothecin.b. CALAA-01 is a targeted nanocomplex that contains anti-R2 siRNA.

2 環(huán)糊精的共價(jià)偶聯(lián)方案

結(jié)構(gòu)決定性質(zhì)，環(huán)糊精由幾個(gè)葡萄糖單元串聯(lián)而成，含有大量的羥基，因此具有較好親水性能?；谶@一特點(diǎn)，與環(huán)糊精共價(jià)偶聯(lián)的藥物水溶性都得到了極大提高。另外，一些疏水性結(jié)構(gòu)的化合物易于進(jìn)入環(huán)糊精的疏水空腔，形成自組裝結(jié)構(gòu)體，例如金剛烷與二茂鐵等。利用這一優(yōu)點(diǎn)，環(huán)糊精可以將不同功能的生物材料方便、靈活、快捷地整合到一體，避免了普通合成化學(xué)的繁瑣步驟。自組裝具有反應(yīng)裝置簡單、反應(yīng)條件平和、操作過程簡便、綠色環(huán)保和易于批量制備等優(yōu)勢(shì)，普通合成化學(xué)手段通常反應(yīng)條件苛刻復(fù)雜，并且不易純化和批量制備。

2.1 共價(jià)偶聯(lián)類藥物載體

在抗腫瘤藥物中，存在大量的藥物由于水溶性較低而不能有效進(jìn)入血液循環(huán)，使得藥效大打折扣?，F(xiàn)階段對(duì)這類藥物的改進(jìn)方法主要是增加親水基團(tuán)，使其擁有較好的水溶性。環(huán)糊精具有親水性能，疏水性抗癌藥物與它共價(jià)偶聯(lián)后能顯著增加水溶性。另外，如果在環(huán)糊精與藥物之間引入酸性敏感的化學(xué)鍵，可以將藥物靶向釋放到病灶部位。

作者課題組選用青蒿素與環(huán)糊精進(jìn)行了共價(jià)偶聯(lián)研究，如圖2所示[13]。2015年，中國女藥學(xué)家屠呦呦獲得了諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)，表彰她發(fā)現(xiàn)的青蒿素使瘧疾患者的死亡率顯著降低。另外有研究發(fā)現(xiàn)青蒿素還具有抗腫瘤的功效[14]，但是青蒿素的水溶性極低，十分不利于它在抗瘧疾與抗腫瘤中的應(yīng)用。為了增加青蒿素的水溶性，先將環(huán)糊精修飾成胺基環(huán)糊精，然后將其與青蒿琥酯進(jìn)行共價(jià)偶聯(lián)，最終形成環(huán)糊精-青蒿前藥[15]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該前藥具有較好的水溶性，同時(shí)體外抗癌效果得到了極大提高。另外，作者課題組還發(fā)現(xiàn)，共價(jià)偶聯(lián)的青蒿素可以自動(dòng)進(jìn)入環(huán)糊精的空腔，這有利于保護(hù)青蒿素中的過氧橋結(jié)構(gòu)，青蒿素的抗瘧疾與抗腫瘤主要的藥效基團(tuán)就是過氧橋[13]。同時(shí),對(duì)燈盞花乙素[16]和大黃酸[17]進(jìn)行類似的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，它們的水溶性和藥效活性都得到了極大提高。

圖2 環(huán)糊精-青蒿琥酯前藥的構(gòu)建[13]Fig.2 Construction process of cyclodextrin-artesunate prodrug[13]

靶向藥物載體是現(xiàn)階段研究熱點(diǎn)之一，因?yàn)樗坏梢蕴岣咚幬锷锢枚龋疫€能降低藥物副作用。葉酸分子目前被廣泛應(yīng)用于靶向藥物載體。前期研究發(fā)現(xiàn)，葉酸受體在腫瘤細(xì)胞表面通常過度表達(dá)(如結(jié)直腸癌細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞和肺癌細(xì)胞等)，而在正常細(xì)胞表面幾乎不表達(dá)，這是由于腫瘤的迅速分化導(dǎo)致其需要大量的葉酸[18]。利用這一特點(diǎn)，作者課題組設(shè)計(jì)了環(huán)糊精-葉酸靶向藥物載體，該載體可以將一些疏水性藥物靶向轉(zhuǎn)運(yùn)到腫瘤細(xì)胞，在腫瘤治療方面具有較好的應(yīng)用前景，如圖3[19]。當(dāng)然，并不是所有的藥物都能被該藥物載體靶向轉(zhuǎn)運(yùn)，前提條件是藥物的立體結(jié)構(gòu)與環(huán)糊精空腔需要完全匹配。

圖3 環(huán)糊精-葉酸靶向藥物載體的傳遞過程示意圖[19]Fig.3 Schematic of the transport process of cyclodextrin-folate targeting drug carrier[19]

單個(gè)環(huán)糊精偶聯(lián)物雖然增加了藥物的水溶性，但缺點(diǎn)是載藥量低，不能使大量藥物同時(shí)到達(dá)病灶組織。針對(duì)這一缺點(diǎn)，Lu等[20]報(bào)道了一種由環(huán)糊精與羧甲基殼聚糖鍵接而成的新型水凝膠藥物載體，如圖4所示。該載體以羧甲基殼聚糖為主鏈，側(cè)鏈共價(jià)修飾大量的環(huán)糊精，使其具有較高的載藥能力。載體中的環(huán)糊精可以自動(dòng)與前藥(金剛烷-多柔比星)完成組裝。這是由于金剛烷的立體結(jié)構(gòu)與環(huán)糊精的疏水空腔恰好能完全匹配。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該藥物載體在酸性條件下能使藥物快速釋放，同時(shí)具有較低的細(xì)胞毒性。作者課題組在聚賴氨酸的側(cè)枝鏈上共價(jià)接枝了大量環(huán)糊精進(jìn)行了類似的研究，該類載體同樣具有較高的載藥能力[21]。

圖4 環(huán)糊精-殼聚糖水凝膠的藥物組裝與釋放機(jī)制[20]Fig.4 Drug assembly and release of cyclodextrin-chitosan hydrogel [20]

2.2 共價(jià)偶聯(lián)類基因載體

基因治療是將外源核酸導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞中，糾正腫瘤細(xì)胞核酸的缺陷或異常，以達(dá)到治療的目的?；蛑委熢谂R床上是否能成功運(yùn)用，很大程度上取決于基因運(yùn)載工具是否高效低毒。近年來，大量的陽離子基因載體被深入研究報(bào)道，比如聚乙烯亞胺(polyethylenimines, PEI)、聚賴氨酸(poly-lysine, PL)、聚酰胺-胺型樹枝高分子(PAMAM)和殼聚糖(chitosans)等[22]。這些載體都能夠同核酸形成帶正電荷的納米粒子，并且可以通過非特異性攝取機(jī)制進(jìn)入細(xì)胞，然而這些載體往往都具有較高的細(xì)胞毒性。這主要是因?yàn)殛栯x子聚合物表面正電荷太高，它在與核酸結(jié)合的同時(shí)，同樣也能與細(xì)胞內(nèi)其它細(xì)胞器相結(jié)合，使其它細(xì)胞器失去相應(yīng)的功能而導(dǎo)致細(xì)胞死亡[23]。針對(duì)這一缺點(diǎn)，作者課題組采用多層“沙-磚策略”設(shè)計(jì)了一種高效低毒并且具有靶向功能的基因載體，如圖5所示[24]。首先構(gòu)筑了3種分子砌塊：乙烯亞胺-環(huán)糊精(PEI-CD)、金剛烷-聚乙二醇(PEG-AD)和金剛烷-葉酸(FA-AD)。然后利用環(huán)糊精與金剛烷的自組裝作用形成納米粒子。粒子表面的聚乙二醇具有掩蔽正電荷的作用，使其降低與其它細(xì)胞器結(jié)合的能力，同時(shí)聚乙二醇能增加載體與細(xì)胞的生物相容性。粒子表面的葉酸能使載體更容易被腫瘤細(xì)胞識(shí)別，使載體具有腫瘤靶向作用，進(jìn)而提高靶向轉(zhuǎn)染效率。

圖5 陽離子聚合物/pDNA靶向傳遞示意圖[24]Fig.5 Schematic illustration of target transfer of polycation/pDNA complexation[24]

Liu等[25]通過二硫鍵將陽離子鏈與環(huán)糊精進(jìn)行偶聯(lián)，使其成為非病毒基因載體的主體結(jié)構(gòu)。為了使該載體具有腫瘤靶向性，他們同樣將葉酸與金剛烷鍵接形成腫瘤靶向配體。該腫瘤靶向配體能通過自組裝作用方便快捷地構(gòu)筑到非病毒基因載體的主體結(jié)構(gòu)上，最終形成具有腫瘤靶向作用的非病毒基因載體。生物實(shí)驗(yàn)表明，在具有氧化還原物質(zhì)的環(huán)境中，該基因載體中的二硫鍵可以有效斷裂，進(jìn)而使基因載體的主體結(jié)構(gòu)裂解，最終導(dǎo)致運(yùn)載的基因高效釋放到腫瘤細(xì)胞內(nèi)。

3 環(huán)糊精的聚輪烷方案

將多個(gè)環(huán)糊精通過一條主鏈聚合串聯(lián)在一起稱為準(zhǔn)聚輪烷。為了預(yù)防鏈上的環(huán)糊精脫離，在主鏈兩端偶聯(lián)上封端劑的聚合物簡稱為聚輪烷。聚輪烷上的環(huán)糊精由于和主鏈?zhǔn)欠枪矁r(jià)鍵結(jié)合在一起，結(jié)合力較弱，所以環(huán)糊精分子可以在主鏈上來回滑動(dòng)與旋轉(zhuǎn)，這樣更有利于對(duì)聚輪烷上的環(huán)糊精進(jìn)行化學(xué)修飾，使聚輪烷具有更多的生物化學(xué)功能。修飾通常是先將環(huán)糊精與主鏈自組裝后再進(jìn)行修飾，如果先修飾環(huán)糊精，由于修飾基團(tuán)位阻太大，主鏈與環(huán)糊精通常就不能自組裝形成聚輪烷，聚輪烷的自組裝與修飾過程如圖6所示。

圖6 聚輪烷的自組裝與修飾過程Fig.6 Self assembly and modification process of polyrotaxane

3.1 輪烷類藥物載體

Li等[26]構(gòu)筑了pH敏感的樹枝狀聚輪烷納米藥物載體，該載體可以有效地將藥物靶向傳遞到腫瘤細(xì)胞內(nèi)，納米粒子藥物釋放過程如圖7所示。該團(tuán)隊(duì)首先利用PEG和環(huán)糊精構(gòu)筑準(zhǔn)聚輪烷，然后在準(zhǔn)聚輪烷兩端使用pH敏感的腙鍵連接阿霉素(DOX)和超支化聚合物進(jìn)行封端，最終形成聚輪烷。聚輪烷一端的DOX為疏水性，另一端的超支化聚合物為親水性，因此該聚輪烷為兩親性聚合物。該聚合物能在水溶液中自動(dòng)形成微膠粒。由于結(jié)構(gòu)中引入了pH敏感的腙鍵，所以該微膠粒能在腫瘤的酸性環(huán)境中能自動(dòng)分解，最終釋放DOX抗癌藥物。另外縮酮鍵也能用在聚輪烷的封端劑中，使聚輪烷成為pH敏感的藥物載體[27]。

作者課題組在聚輪烷的基礎(chǔ)上對(duì)環(huán)糊精進(jìn)行了化學(xué)修飾，使聚輪烷成為超支化聚合物，進(jìn)而擁有較高載藥能力[28]。首先利用聚丙二醇與碘代環(huán)糊精自組裝構(gòu)筑準(zhǔn)聚輪烷，隨后利用葉酸對(duì)準(zhǔn)聚輪烷進(jìn)行封端，封端后的聚輪烷具有葉酸介導(dǎo)的腫瘤靶向性，然后在環(huán)糊精上修飾偶聯(lián)青蒿琥酯，如圖8所示。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，封端劑在酸性條件下會(huì)自動(dòng)脫離，導(dǎo)致聚輪烷裂解，進(jìn)而釋放出環(huán)糊精-青蒿琥酯前藥。釋放的前藥同樣在酸性條件下發(fā)生酯鍵斷裂，最終釋放青蒿琥酯。

圖7 pH敏感的樹枝狀聚輪烷納米粒子藥物釋放過程[26]Fig.7 Illustration on micelles selectively releasing drugs at endosomal compartments activated by acidic pH[26]

圖8 青蒿琥酯-聚輪烷的構(gòu)筑過程[28]Fig.8 Construction process of artesunate-polyrotaxane[28]

3.2 輪烷類基因載體

正如前文所提及，基因載體能夠有效結(jié)合基因的前提條件是載體中含有陽離子聚合物。Li課題組最先將環(huán)糊精陽離子聚輪烷用于構(gòu)筑非病毒基因載體：先用環(huán)糊精與聚丙二醇制備成聚輪烷，然后在環(huán)糊精上偶聯(lián)陽離子鏈，使環(huán)糊精聚輪烷具有陽離子特征[29]。另外, Liu課題組研究發(fā)現(xiàn)在陽離子鏈上進(jìn)一步偶聯(lián)平面分子后，該輪烷具有更好的凝聚效果，因?yàn)槠矫娣肿涌梢院虳NA雙螺旋大溝槽結(jié)合，使基因載體與DNA結(jié)合更為緊密，如圖9所示[30]。

圖9 平面分子與DNA的結(jié)合示意圖[30]Fig.9 Schematic of the combination of planar molecules with DNA[30]

作者課題組設(shè)計(jì)了一種新型的環(huán)糊精聚輪烷基因載體，如圖10所示。首先利用環(huán)糊精與聚丙二醇制備聚輪烷，兩側(cè)封端劑為具有腫瘤靶向的葉酸分子。然后在環(huán)糊精上先偶聯(lián)三乙烯四胺陽離子鏈形成陽離子聚輪烷，最后在陽離子末端偶聯(lián)天然藥物燈盞花乙素作為平面分子。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，偶聯(lián)了平面分子的聚輪烷,其凝聚能力明顯強(qiáng)于未偶聯(lián)平面分子的聚輪烷。其中的燈盞花乙素不但可以作為平面分子增強(qiáng)凝聚能力，而且還可以作為藥物用于腫瘤的治療?？傊摼圯喭槟芡瑫r(shí)傳遞基因與藥物到靶細(xì)胞[31]。

圖10 基于環(huán)糊精的聚輪烷藥物載體與基因載體示意圖[31]Fig.10 Schematic of drug carrier and gene vector of polyrotaxane based on cyclodextrin[31]

4 結(jié) 語

實(shí)現(xiàn)藥物對(duì)靶標(biāo)組織或器官特異性的分布是目前藥物研究面臨的主要瓶頸。精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)探索的基礎(chǔ)之一就是將藥物精準(zhǔn)投遞進(jìn)行個(gè)體化治療。精準(zhǔn)投遞可以使最低劑量的藥物在最低副作用下達(dá)到最高的生物利療效。納米藥物與基因載體普遍具有高效、低毒的優(yōu)勢(shì)和靶向轉(zhuǎn)運(yùn)能力，這恰恰是精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的追求目標(biāo)之一。但是納米藥物與基因載體結(jié)構(gòu)復(fù)雜、構(gòu)筑繁瑣，普通合成化學(xué)手段難以成功構(gòu)筑，環(huán)糊精超分子自組裝的出現(xiàn)為構(gòu)筑納米藥物與基因載體提供了方便、快捷、靈活的手段。

構(gòu)筑生物安全的納米藥物與基因載體是實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)治療的前提與保障。正如上文所提及，納米藥物與基因載體結(jié)構(gòu)復(fù)雜，往往是多種材料的組合，既要保證載體具有運(yùn)載能力，又要保證載體具有生物相容性，這將是設(shè)計(jì)納米藥物與基因載體的主要挑戰(zhàn)。此外，我們必須要充分認(rèn)識(shí)到人體是個(gè)復(fù)雜的機(jī)體，內(nèi)部環(huán)境因素多種多樣，納米藥物與基因載體能否排除各種干擾因素，實(shí)現(xiàn)藥物的高效、低毒靶向釋放也是將要面臨的主要挑戰(zhàn)。

總之，要將這些成果轉(zhuǎn)移到臨床研究階段依舊任重道遠(yuǎn)，但是科學(xué)研究本身是長期工作積累的過程，相信隨著對(duì)環(huán)糊精構(gòu)筑的納米藥物與基因載體的深入探索，以上挑戰(zhàn)將會(huì)被逐一化解。