小檗堿對口服降糖藥糖尿病患者的胃腸激素及腸道菌群的影響

熊紅萍，徐靜，周強(qiáng)，吳埼淇，甘國翔，陳忠山

(1.廈門大學(xué)附屬福州市第二醫(yī)院，福建 福州 350007；2.廈門大學(xué)，福建 廈門 361102；3.福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建 福州 350122)

糖尿病常累及消化道，出現(xiàn)如腹脹、納差、惡心等癥狀，稱為糖尿病性胃腸病變。一般認(rèn)為糖尿病性胃腸病與糖尿病植物神經(jīng)病變有關(guān)。而胃腸功能的改變與胃、腸、胰等激素有密切關(guān)系。黃連素是從中藥黃連中提取的單體，又稱小檗堿(Berberine)，是一種很有臨床應(yīng)用前景的降糖藥物。筆者通過口服降糖藥物聯(lián)合小檗堿對2型糖尿病患者進(jìn)行為期12周臨床治療，觀察小檗堿對糖尿病患者胃泌素、胰高血糖素及腸道菌群的影響，探討治療2型糖尿病的新療法。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

治療組選擇2017年1月—2017年10月就診于廈門大學(xué)附屬福州市第二醫(yī)院內(nèi)分泌門診及住院病區(qū)的口服降糖藥的2型糖尿病患者，對照組選取同期體檢中心體檢的健康人群。其中治療組25例，男/女為11/14例，平均年齡(57.8±9.6)歲，平均BMI(26.9±4.4)kg/m2,平均腹圍(94.6±9.6)cm，平均病程(4.9±3.4)年。健康對照組10例，男/女為5/5例，平均年齡(48.5±12.4)歲，平均BMI(24.7±6.0)kg/m2,平均腹圍(87.1±17.0)cm。兩組年齡、性別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 入選標(biāo)準(zhǔn)

糖尿病患者符合2013版中國2型糖尿病防治指南[1]且谷氨酸脫羧酶抗體(GADAb)、胰島細(xì)胞自身抗體(ICA)均為陰性，近4周未服用雙胍類、α葡萄糖苷酶抑制劑、二肽基肽酶抑制劑(DPP-4)、胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)受體激動劑、小檗堿、抗生素、微生態(tài)活菌制劑及乳果糖等藥物，入選患者依從性較好，簽署知情同意書，能配合各項檢查。健康對照組人群經(jīng)口服葡萄糖耐量試驗(OGTT)證實血糖正常，同意參加本實驗，簽署知情同意書的健康體檢者，年齡≥20歲。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn)

(1)嚴(yán)重感染；(2)嚴(yán)重肝腎疾患及心功能不全；(3)1型糖尿病及使用胰島素治療的2型糖尿病患者;(4)胃腸、胰腺疾病及胃腸手術(shù)史；(5)酮癥酸中毒及高滲性昏迷；(6)甲狀腺功能異常；(7)孕婦及哺乳期婦女。

1.4 方法

1.4.1 基本參數(shù)測量

入選對象均于入選當(dāng)日由專人用標(biāo)準(zhǔn)體重計、身高測量計分別測量身高(cm)、體重(kg)，BMI=體重(kg)/身高(m2)，空腹?fàn)顟B(tài)下測腰圍(cm)。

1.4.2 生化指標(biāo)測定及腸道菌群培養(yǎng)

治療組根據(jù)血糖情況調(diào)整降糖藥，同時給予鹽酸小檗堿(東北制藥集團(tuán)沈陽第一制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H21022453)每次500 mg，每日3次，連續(xù)12周。治療組分別于0、4、8、12周清晨空腹分別采集靜脈血標(biāo)本，測定血漿葡萄糖濃度(采用貝克曼庫爾特公司AU5811儀器，己糖激酶法測定)、胃泌素(采用西門子DPC IMMULITE化學(xué)發(fā)光儀，化學(xué)發(fā)光法測定)、胰高血糖素(采用γ-計數(shù)儀，放射免疫法測定)，于75 g口服葡萄糖耐量實驗后60 min測定餐后1 h血糖。于0周、12周囑受試者將清晨空腹糞便排泄到糞便采集盒上，用無菌采集勺取排泄出來的中后段糞便1 g于含有保存液的TinyGene糞便DNA保存管(產(chǎn)品編號：CJ-01KA)中,通過上下震蕩搖晃，使樣品完全浸入保存液中，擰緊管蓋，將保存管放到-20℃冰箱進(jìn)行冷凍存儲。在采集完成后10日內(nèi)將采集到的所有樣品送檢至由維基生物科技(上海)有限公司采用Realtime PCR技術(shù)進(jìn)行測定。通過熒光定量的方法對16S基因進(jìn)行定量。所用引物分別為515F/926R。qPCR反應(yīng)在專用的PCR八連管(Axygen, USA)中進(jìn)行，25 μL體系。所有樣品做3個重復(fù)，使用Takara的SRBR Premix Ex TaqTM試劑盒。對照組只進(jìn)行0周的靜脈采血及糞便菌群培養(yǎng)。

治療組在服藥期間每周進(jìn)行電話隨訪，記錄服藥后情況及是否有不良反應(yīng)。服藥期間維持原生活習(xí)慣及飲食習(xí)慣。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 生化指標(biāo)

見表1～表4。由表1表2可知治療組治療后空腹血糖及餐后1h血糖有不同程度的下降，同組治療前后差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。由表3可知與0周比較，治療組治療后胃泌素水平持續(xù)升高(P<0.05)。治療組治療前后胃泌素水平均明顯高于對照組(P<0.05)。由表4可知治療組治療后胰高血糖素均明顯高于對照組(P<0.05)，治療前后無差異(P>0.05)。

2.2 腸道菌群

見表5、表6。由表5可知治療前治療組厚壁菌門明顯高于治療后(P<0.05)。治療后治療組大腸桿菌屬明顯高于治療前(P<0.05)。治療后治療組厚壁菌門明顯低于對照組(P<0.01)。由表6可知治療前后治療組擬桿菌均明顯低于對照組(P<0.05)。治療前治療組柔嫩梭菌屬明顯低于對照組(P<0.01)。

表1 治療前后空腹血糖的變化

注：與0周比較，*P<0.05

表2 治療前后餐后1 h血糖的變化

注：與0周比較，*P<0.05，**P<0.01

表3 治療前后胃泌素的變化

注：與0周比較，**P<0.01；與對照組比較，△△P<0.01

表4 治療前后胰高血糖素的變化

注：與對照組比較，△P<0.05

表5 治療前后腸道菌群的變化

注：與0周比較，*P<0.05;與對照組比較，△△P<0.01

表6 治療前后腸道菌群的變化

注：與對照組比較，△P<0.05，△△P<0.01

3 討論

糖尿病是一種嚴(yán)重危害人類健康的全身慢性疾病，其病因與發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，至今尚未完全闡明，目前認(rèn)為胰島素分泌缺陷和胰島素抵抗是2型糖尿病發(fā)病機(jī)制的兩個基本環(huán)節(jié)。生理狀態(tài)下機(jī)體血糖維持穩(wěn)定依賴于精細(xì)的神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)，多種內(nèi)分泌激素參與調(diào)節(jié)血糖使之保持在一定范圍內(nèi)的穩(wěn)定狀態(tài)。近年來研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者胰島素分泌異常的同時，胰高血糖素(glugacon，GLC)水平亦明顯升高[2]，提示糖尿病患者可能同時存在α細(xì)胞胰島素抵抗。作為胰島素的拮抗激素，胰高血糖素是由僅占胰島10%的α細(xì)胞分泌，是影響機(jī)體血糖波動的重要因素[3]，當(dāng)人體攝入食物后，血糖濃度升高，刺激胰腺β細(xì)胞分泌胰島素，胰島素通過胰腺旁分泌機(jī)制抑制α細(xì)胞分泌胰高血糖素。但當(dāng)胰島β細(xì)胞功能進(jìn)行性下降時，胰島素分泌不足，不能有效地抑制α細(xì)胞分泌胰高血糖素，胰高血糖素隨之升高。升高后的胰高血糖素具有促進(jìn)糖原分解和糖異生的作用，進(jìn)一步加劇了糖尿病的進(jìn)程。Unger[4]提出“雙激素”學(xué)說認(rèn)為 T2DM 患者血糖水平升高不能正常抑制胰高血糖素的分泌，有胰島素和胰高血糖素紊亂的參與。胰高血糖素絕對或相對過多是造成糖尿病高血糖的重要因素之一。本研究發(fā)現(xiàn)，胰高血糖素治療后均明顯高于正常對照組(P<0.05)，與該學(xué)說相一致。胰島素分泌的相對不足和胰高血糖素分泌的相對過剩是同時存在的。胰高血糖素對于高血糖的調(diào)節(jié)起著重要作用，有關(guān)胰高血糖素分泌異常的調(diào)節(jié)機(jī)制研究可能成為治療糖尿病的新靶點。

胃泌素是主要由胃竇和十二指腸G細(xì)胞分泌釋放一種由17個氨基酸組成的多肽，對糖尿病的一些并發(fā)癥例如糖尿病性神經(jīng)病變、糖尿病性胃腸病變的發(fā)生有著重要意義?，F(xiàn)已知其生物學(xué)功能主要是調(diào)節(jié)胃相胃酸分泌和刺激胃黏膜生長，但近年來隨著對胃泌素作用機(jī)制的不斷探索，發(fā)現(xiàn)黏膜營養(yǎng)和促進(jìn)細(xì)胞增殖也是其重要的生物學(xué)功能[5]。有研究發(fā)現(xiàn)外源性注射胃泌素能誘導(dǎo)β細(xì)胞的再生，是介導(dǎo)胰島再生的一種生長因子。該研究還發(fā)現(xiàn)，高胃泌素血癥患者伴有胰島細(xì)胞畸形生長，胰島素分泌顯著增加，萎縮性胃炎患者的血清胰島素水平也有升高[6]。動物實驗發(fā)現(xiàn)胚胎小鼠胰腺中即有胃泌素表達(dá)，提示胃泌素可能與胰腺早期發(fā)育有關(guān),且胚胎時期胃泌素的主要靶器官也可能是胰腺[7]?？梢?，外源性和內(nèi)源性胃泌素均可增加胰島素的分泌，但機(jī)制尚不明確。本研究發(fā)現(xiàn)治療組胃泌素均明顯高于對照組(P<0.01)，提示2型糖尿病胃泌素可能高于健康人群,可能與胰島素抵抗有關(guān)。胰島素抵抗促進(jìn)了葡萄糖攝取，但胰島素的生物利用效率下降，機(jī)體代償性的分泌過多胰島素產(chǎn)生高胰島素血癥，以維持血糖的穩(wěn)定，是2型糖尿病的始動環(huán)節(jié)，并且參與到2型糖尿病的發(fā)生、發(fā)展過程中。因此，能否通過補充外源性胃泌素來增加胰島素的分泌，這可能是糖尿病治療的一個新方向，有待進(jìn)一步研究。

人體的腸道內(nèi)寄居著數(shù)以萬億的細(xì)菌，這些細(xì)菌組成了人體最大的微生物群，即腸道菌群。微生態(tài)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群數(shù)量與糖尿病的發(fā)生發(fā)展有一定的關(guān)系。當(dāng)血糖值偏高時(>20 mmol/L，小鼠)，腸道內(nèi)的有益菌(雙歧桿菌、乳酸桿菌等)數(shù)量減少;藥物治療后，血糖值降低(<14 mmol/L，小鼠)，有益菌數(shù)量增加，表現(xiàn)出腸道菌群的數(shù)量變化與血糖值變化呈負(fù)相關(guān)[8]。目前國內(nèi)研究顯示2型糖尿病亦存在明顯炎癥表現(xiàn)[9]，有研究結(jié)果提示柔嫩梭菌屬具有抗炎作用，對宿主有益[10]，而本研究發(fā)現(xiàn)有抗炎作用的柔嫩梭菌屬明顯低于對照組(P<0.01)，考慮可能是糖尿病患者體內(nèi)炎癥反應(yīng)造成具有抗炎作用的細(xì)菌失衡。國內(nèi)亦有作者研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者擬桿菌屬較健康人群顯著減少[11]。本研究中治療組擬桿菌屬明顯低于對照組(P<0.05)，還觀察到厚壁菌門含量在治療組中稍高,但兩組差異不顯著(P>0.05)，考慮可能跟治療組納入人群肥胖，而對照組相對于治療組BMI、腹圍較低(P>0.05)有關(guān)。本次還觀察到大腸桿菌屬在對照組中稍高,但無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，可能與標(biāo)本污染或樣本量少有關(guān)，統(tǒng)計誤差造成。乳酸桿菌在治療組中稍高，但與對照組比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

糖尿病在中醫(yī)學(xué)屬于消渴的范疇，早在唐代名醫(yī)孫思邈所著的《千金要方》中就有黃連配伍生地治療消渴癥的記載。黃連素是從中藥黃連中提取的單體，又名小檗堿，《本草正義》中提到“黃連大苦大寒，苦燥濕，寒勝熱，能泄一切有余之火”，是黃連解毒湯、玉女煎等瀉火藥中的主藥，尤其善清中焦?jié)駸?，故為中焦?jié)駸嵯实囊帯，F(xiàn)代藥理學(xué)發(fā)現(xiàn)小檗堿對修復(fù)細(xì)胞、抗炎有一定作用，且抗菌譜廣，對多種革蘭陽性菌和革蘭陰性菌均有作用[12]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿具有調(diào)節(jié)腸道菌群，增加糖酵解，抑制肝臟糖原生成，減少糖異生，減輕胰島素抵抗，改善胰島β細(xì)胞功能作用，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝等作用[13]。對于小檗堿降血糖機(jī)制的研究已經(jīng)成為糖尿病治療的新熱點。小檗堿與二甲雙胍的降糖作用相似，一項納入36名新診斷2型糖尿病患者單用小檗堿(500 mg,每日3次)3個月后糖化血紅蛋白顯著降低,從(9.5±0.5)%～(7.5±0.4)%，P<0.01，甘油三酯下降,從(1.13±0.13)mmol/L～(0.89±0.03)mmol/L,P<0.05[14]。Zhang X[15]等研究發(fā)現(xiàn)小檗堿調(diào)節(jié)腸道菌群的作用，同時可升高瘦素、降低血清脂聯(lián)素水平，提示其可改善胰島素抵抗的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿干預(yù)的糖尿病患者治療前厚壁菌門明顯高于治療后(P<0.05)，胃泌素整體較0周明顯上升(P<0.01)，治療后血糖下降(P<0.05)，證實了黃連素具有改善腸道菌群失調(diào)的作用，同時還觀察到小檗堿對胃腸激素紊亂有改善作用，但對二者的調(diào)節(jié)是協(xié)同或是單獨作用還有待進(jìn)一步研究，筆者推測可能是腸道菌群紊亂的糾正，抑制了胃腸道對脂肪的吸收，改善了體內(nèi)糖脂代謝紊亂，減輕了胰島素抵抗，從而刺激胃泌素的升高，增加了胰島β細(xì)胞分泌胰島素的功能，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

目前關(guān)于腸道菌群失調(diào)參與2型糖尿病患者胰島素抵抗，糖脂代謝紊亂的發(fā)現(xiàn)得到越來越多學(xué)者的認(rèn)可，關(guān)于小檗堿調(diào)節(jié)腸道菌群紊亂，降低血糖的研究越來越多，預(yù)示小檗堿對于2型糖尿病治療的廣闊前景。但由于腸道微生態(tài)太過復(fù)雜且研究方法繁多，各項關(guān)于腸道菌群的研究結(jié)果不盡相同。本次研究雖然發(fā)現(xiàn)2型糖尿病患者存在腸道菌群紊亂的現(xiàn)象，小檗堿具有一定改善腸道菌群失調(diào)，刺激胃泌素的分泌，可能參與了降糖過程。但同時本研究也存在一定不足，由于是前瞻性研究，研究樣本量小，缺少常規(guī)藥物治療組對照組，陽性指標(biāo)有限，胰高血糖素治療前后雖有降低，但無統(tǒng)計學(xué)差異，未觀察到乳酸桿菌、雙歧桿菌益生菌的治療前后的差異。小檗堿通過調(diào)節(jié)腸道菌群治療糖尿病仍然需更大的樣本量及更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)呐R床實驗來評估。