基于共價接枝的鈦種植體載藥抗菌涂層的研究進展

劉育豪 袁泉 張士文

口腔疾病研究國家重點實驗室 國家口腔疾病臨床醫(yī)學研究中心四川大學華西口腔醫(yī)院種植科 成都 610041

牙科鈦種植體的10年成功率已達90%以上，已廣泛用于牙列缺損或缺失患者的修復[1]。然而，植入?yún)^(qū)骨質(zhì)條件差、患有糖尿病等基礎(chǔ)疾病、種植體周圍發(fā)生感染等因素仍是種植體長期存留的隱患[2]。有研究顯示，術(shù)后5年的種植體周圍感染（peri-implant infection）發(fā)生比例可達14%[1]。感染早期表現(xiàn)為種植體周圍黏膜炎，僅累及種植體周圍的軟組織，而晚期表現(xiàn)為種植體周圍炎，除造成種植體周圍軟組織炎癥外，還伴有種植體周圍支持骨的吸收，甚至還會導致種植體松動及脫落[3-4]。因此，減少種植體周圍感染的發(fā)生已成為口腔種植學領(lǐng)域的熱點及難點。

另一方面，過去對種植體改性的研究集中于通過優(yōu)化種植體表面的形貌、化學成分、親水性等性能，進而促進其骨結(jié)合能力[5]。例如，有研究[6]證實多孔表面（微米級或納米級）更利于建立骨結(jié)合。近來的研究[7-8]指出，表面粗糙度的增加也會促進細菌的黏附和增殖，更容易形成菌斑生物膜，不利于減少種植體周圍感染的發(fā)生。因此，以提高抗菌性能為宗旨的表面改性已成為新的研究方向，例如調(diào)控表面粗糙度或親水性以抑制細菌黏附[9]，構(gòu)建有抗菌性的聚合物涂層（如殼聚糖涂層）以及構(gòu)建載藥涂層。載藥涂層可釋放藥物至種植體周圍區(qū)域以實現(xiàn)主動且強效的抗菌作用，對于減少周圍感染的發(fā)生極具前景[10]。

圖1 物理混合載藥涂層

圖2 共價接枝載藥涂層Fig 2 Covalent grafting drug-loaded coatings

構(gòu)建載藥種植體的難點在于如何實現(xiàn)藥物與種植體表面的結(jié)合，結(jié)合方式對藥物的釋放效率及抗菌性能有重要影響。過去的研究主要集中于將抗菌藥物通過物理混合的方式直接載入各類表面涂層材料，包括羥磷灰石涂層[11]、二氧化鈦納米管[12]、聚合物涂層[13-14]等。藥物通過物理吸附的方式存留于涂層孔隙中，擴散至種植體周圍區(qū)域發(fā)揮抗菌作用（圖1）。然而，基于物理吸附的載藥種植體的顯著缺點是其藥物釋放呈現(xiàn)為最初的短期“爆發(fā)式釋放”及后續(xù)的緩慢少量釋放[15]，難以實現(xiàn)感染的長期預防，而且容易產(chǎn)生細菌耐藥性。因此，共價接枝法（covalent grafting）逐漸受到學者關(guān)注（圖2）。共價固定的藥物可長期存留于種植體表面，在局部持續(xù)發(fā)揮較強的抗菌作用，是極具前景的載藥方式。

1 共價接枝載藥抗菌涂層的構(gòu)建

共價接枝指的是藥物分子直接通過共價鍵固定于材料表面，或者通過接枝分子間接共價固定于材料表面。對于后者，接枝分子的一端與材料表面形成共價鍵，而另一端與藥物分子的特定基團形成共價鍵，在確保共價接枝穩(wěn)定性的同時，可提高藥物分子的移動性，以提高抗菌性能，因此成為主要接枝方式。

1.1 抗菌藥物

早在十余年前已有研究將抗生素用作種植體抗菌涂層，取得良好抗菌效果。例如Edupuganti等[16]通過雙乙二醇將萬古霉素共價固定于鈦表面，在生理緩沖液中保存44 d后仍未觀察到金黃色葡萄球菌定植。因抗生素抗菌機制確鑿，且多類抗生素各具優(yōu)異性能，例如桿菌肽[17]可同時抑制革蘭陽性菌并促進干細胞成骨分化，多西環(huán)素[18]對牙周病及種植體周圍炎有特異性抗菌作用，近年來仍不斷有研究將各類抗生素用于種植體抗菌涂層。然而，隨著抗生素的濫用，細菌的耐藥性已成為全球醫(yī)療界的棘手難題，非抗生素類藥物已受到學界越來越多的關(guān)注（表1[19-27]）。

銀離子是一種高效的廣譜殺菌劑，在極低濃度下即有抗菌或殺菌作用，同時對人體正常細胞沒有或僅有微弱的毒性。其抗菌機制主要包括破壞細胞壁和細胞膜進而引起破裂穿孔，以及破壞細胞內(nèi)蛋白質(zhì)和核酸。已有較多研究將銀離子引入種植體抗菌涂層，但其濃度選擇以及長期毒性仍有待進一步的確定。

1.2 接枝分子

多種接枝分子（例如聚乙二醇[20]、硅烷偶聯(lián)劑[28-29]、磷酸自組裝單分子層[22]、多巴胺/聚多巴 胺[30]等）已被學者用于構(gòu)建種植體載藥涂層。

表1 共價接枝載藥抗菌涂層采用的非抗生素類藥物Tab 1 Non-antibiotics used in covalently grafted antimicrobial coatings

目前，在接枝分子的選擇上，需重點考慮其構(gòu)建載藥涂層的便捷度與靈活性。多巴胺/聚多巴胺涂層近年來在生物材料表面修飾領(lǐng)域內(nèi)受到大量關(guān)注。將鈦浸于多巴胺單體溶液即可獲得結(jié)合牢固的聚多巴胺涂層，相比于其他分子的共價接枝，該制備過程兼具簡易與高效的優(yōu)勢[31]。此外，聚多巴胺分子中含有多種官能團，使其可與多類基團以不同類型共價鍵結(jié)合，大大提高了結(jié)合藥物的靈活性。

另一重點考慮的因素是，接枝分子的結(jié)構(gòu)性質(zhì)對于載藥涂層的抗菌性能有顯著影響。例如Nie等[20]通過聚乙二醇將KR-12多肽（抗菌肽LL-37的衍生物）共價固定于鈦表面，與通過硅烷偶聯(lián)劑將KR-12多肽共價固定進行比較。結(jié)果顯示，前者能夠更為顯著地降低表皮葡萄球菌的黏附與生物膜形成。研究者認為聚乙二醇具有更長的分子鏈，增強了KR-12多肽的移動性，更有利于接觸并殺滅細菌。類似地，Godoy-Gallardo等[19]通過表面引發(fā)原子轉(zhuǎn)移自由基聚合技術(shù)在鈦表面引入接枝分子鏈，其與抗菌肽hLf1-11共價連接。與通過硅烷偶聯(lián)劑共價固定相比，該載藥涂層對血鏈球菌和唾液乳桿菌的黏附具有更強的抑制作用。該接枝分子除具有更長的分子鏈外，其顯著優(yōu)勢為整條分子鏈上可連續(xù)密集排列抗菌肽hLf1-11，而非僅在分子鏈末端連接，因此顯著提高了局部藥物濃度，進而提高了抗菌性能（圖2）。

2 共價接枝載藥抗菌涂層的應用優(yōu)勢

2.1 優(yōu)化藥物釋放模式

通過物理吸附法將藥物固定于羥磷灰石等種植體表面涂層內(nèi)，藥物釋放通常呈現(xiàn)為初期的數(shù)小時“爆發(fā)式釋放”及后續(xù)的數(shù)天少量釋放。高濃度藥物對人體正常細胞有潛在的毒性作用[15]，而低濃度藥物則可能引起耐藥性[32]。通過共價接枝將藥物固定于種植體表面，可明顯限制其釋放速率，使其在至少數(shù)周內(nèi)維持局部高抑菌濃度[16,33]，以實現(xiàn)較強的抗菌作用。此外，因僅有抑菌濃度的藥物持續(xù)釋放，對周圍的人體正常組織的毒性作用較小[34]。

2.2 改變藥物的抗菌機制

共價接枝不僅通過維持局部高抑菌濃度來提高抗菌作用，同時也可能賦予抗菌物質(zhì)新的抗菌機制。以抗菌肽為例，破壞細胞膜及細胞內(nèi)殺菌是游離抗菌肽的主要抗菌機制。Gao等[35]通過親水性接枝分子將抗菌肽共價固定于鈦表面，體外及體內(nèi)實驗證實該載藥涂層有顯著的抗菌作用。該實驗中的抗菌肽由12個氨基酸組成，其長度最多為5.5 nm，而革蘭陰性細菌的細胞膜厚度為20～80 nm，因此幾乎不可能進入細菌細胞質(zhì)。研究者推測，共價固定造成了局部高濃度正電荷，基于靜電相互作用（electrostatic interaction）而非穿胞裂解，干擾了細菌帶負電荷的細胞膜，最終造成細菌自溶/死亡。游離抗菌肽的穿胞作用與細菌細胞膜蛋白質(zhì)等結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，因而細菌可能發(fā)生細胞膜蛋白質(zhì)構(gòu)象改變等變異，導致耐藥性的產(chǎn)生[36]。大部分細菌表面帶負電荷，且細菌難以在攜帶電荷的性質(zhì)上發(fā)生改變，因此基于靜電相互作用的抗菌機制很可能更利于減少耐藥性的產(chǎn)生。此外，共價固定的銀化合物也可能存在類似的抗菌機制轉(zhuǎn)變。

2.3 提高藥物穩(wěn)定性

Holmberg等[21]用硅烷偶聯(lián)劑將抗菌肽GL13K共價固定于鈦表面，與共價固定非抗菌性多肽的鈦表面相比，前者對牙齦卟啉單胞菌有更強的抑制作用。牙齦卟啉單胞菌是引起種植體周圍炎的重要細菌，可溶性抗菌肽GL13K對部分牙齦卟啉單胞菌菌株的抗菌作用不顯著，因為這些菌株分泌的牙齦菌蛋白酶（gingipain）可破壞其活性[37]。研究者推測，雖然牙齦卟啉單胞菌分泌的牙齦菌蛋白酶游離于周圍液體環(huán)境中，但該實驗中抗菌肽GL13K接枝于鈦表面，受共價鍵限制而無法游離至周圍環(huán)境中，在很大程度上避免了與蛋白酶接觸，因而抗降解能力顯著提升，可發(fā)揮可溶性抗菌肽GL13K不具備的抗菌作用。

3 共價接枝載藥抗菌涂層的不足

相對于傳統(tǒng)載藥方式，現(xiàn)階段的共價接枝技術(shù)也有不足之處。首先，因共價接枝法需將藥物分子嚴格地以共價鍵連接到鈦表面，常涉及較為繁瑣或苛刻的化學反應步驟，不僅有試劑殘留的可能性，而且構(gòu)建流程耗時且昂貴，難以投入實際生產(chǎn)[38]。因此應重視簡化共價接枝涂層的制備過程，以及嚴格檢測各類化學試劑的表面含量。其次，當共價接枝多肽/蛋白質(zhì)類藥物時，藥物分子的部分基團參與共價鍵的形成后可能引起局部或整體的分子構(gòu)象改變，使得發(fā)揮抗菌作用的相關(guān)位點難以暴露于分子表面或難以呈現(xiàn)最佳的排列方式，最終降低抗菌活性[34]。后續(xù)研究應對這一現(xiàn)象深入印證并探討改善策略。此外，因目前相關(guān)研究主要處于體外實驗階段，共價接枝載藥抗菌涂層在體內(nèi)環(huán)境中的抗菌作用是否會受某些因素影響，以及是否會產(chǎn)生目前未知的不良反應，仍待觀察與探索。

4 共價接枝載藥抗菌涂層的發(fā)展方向

4.1 繼續(xù)優(yōu)化藥物釋放模式

共價固定的藥物發(fā)揮抗菌作用主要依賴于局部作用而非藥物釋放。最近有學者[32,39]提出一種新穎的“智能釋放”（smart release）模式，其設想為藥物載體可感受周圍環(huán)境的變化，在合適的時機釋放藥物。對于共價接枝構(gòu)建載藥抗菌涂層而言，可設計特定的接枝分子，沒有細菌侵入時其與藥物分子保持穩(wěn)定連接，維持局部高藥物濃度；而當引起種植體周圍感染的相關(guān)細菌（例如牙齦卟啉單胞菌）侵入時，接枝分子的特定結(jié)構(gòu)可被細菌分泌的特異性蛋白酶降解，引起藥物迅速釋放而有效殺滅周圍細菌，阻止感染發(fā)生。

4.2 建立抗菌性能的評價模型

當前的研究對于載藥種植體抗菌性能的評價主要通過體外實驗進行，如測定細菌在材料表面的黏附、增殖情況，較少有研究使用動物模型評價抗菌性能[40]。目前尚缺少能同時評價材料成骨性能和抗菌性能的標準化方法[7,41]。建立能夠同時模擬成骨微環(huán)境及感染發(fā)展過程的動物模型，對于全面評價載藥抗菌涂層性能有重要意義。

4.3 改善抗菌涂層的成骨性能

雖然共價固定的抗菌藥物被局限于種植體表面區(qū)域，與周圍的人體正常組織相互作用較小，仍有學者認為需提高其成骨性能，以彌補潛在的不良反應。有研究[17]轉(zhuǎn)而采用既有促進成骨性能又有抗菌活性的藥物，例如桿菌肽。也有研究[42-43]將RGD多肽與抗菌肽同時共價固定于鈦表面。因RGD多肽有良好的骨相容性，與抗菌肽以適宜比例共存于鈦表面時，可兼顧鈦種植體的骨整合性能與抗菌性能。

綜上所述，基于共價接枝的鈦種植體載藥抗菌涂層發(fā)展迅速且前景良好，其特征為將藥物共價固定于種植體表面以實現(xiàn)局部長期作用，與其他載藥方式相比具有優(yōu)化藥物釋放模式、改變藥物抗菌機制、提高藥物穩(wěn)定性等優(yōu)點。后續(xù)研究應進一步改良共價接枝載藥涂層的綜合性能，且深入開展動物實驗以探究材料在體內(nèi)環(huán)境中的生物學效應，以期切實提高其應用價值，并盡早轉(zhuǎn)化至臨床應用。