病毒基因工程藥物研究進(jìn)展

李遠(yuǎn)遠(yuǎn)，王鋆坦，李彩霞，徐鐘

(河南省科學(xué)院商業(yè)科學(xué)研究所，鄭州 450002 )

用活體微生物藥物治療細(xì)菌感染源于20世紀(jì)早期，微生物學(xué)家Felix d’Herelle利用噬菌體治愈痢疾，并開發(fā)出針對(duì)不同疾病的噬菌體載體藥物[1,2]，但噬菌體療法并不穩(wěn)定，其光芒被隨后發(fā)現(xiàn)的第一種抗生素類藥物青霉素所掩蓋。與噬菌體藥物相比，抗生素類藥物性質(zhì)穩(wěn)定便于儲(chǔ)存和運(yùn)輸、抗菌譜廣、免疫原性弱，具有更高的開發(fā)價(jià)值。近年來，隨著抗生素的廣泛使用，病原菌對(duì)抗生素的耐藥性越來越強(qiáng)，而新抗生素的發(fā)現(xiàn)變緩，亟需開發(fā)出替代抗生素治療的方案。病毒基因工程藥物最大的優(yōu)勢(shì)是能夠自我繁殖，可以達(dá)到持續(xù)用藥的效果，以病毒為載體，通過對(duì)其效應(yīng)物表達(dá)的調(diào)控，可以控制其給藥時(shí)間、部位及用藥量，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)用藥，減少藥物對(duì)正常細(xì)胞的毒副作用。我們將在本文中介紹以病毒為治療載體的藥物研究進(jìn)展，比較不同病毒的特點(diǎn)，效應(yīng)物分子的表達(dá)調(diào)控以及在疾病治療中的應(yīng)用。

1 病毒載體藥物

病毒通過將遺傳信息整合到宿主細(xì)胞的基因組中，利用宿主細(xì)胞的復(fù)制和表達(dá)系統(tǒng)合成自身原件并殺死宿主。一些病毒具有腫瘤選擇性，例如M1病毒、細(xì)小病毒、牛痘病毒等，將這些病毒進(jìn)行遺傳改造，以提高他們對(duì)癌癥細(xì)胞的選擇性和減少對(duì)正常細(xì)胞的毒性，用于腫瘤治療。以細(xì)菌為食的病毒被稱為噬菌體，噬菌體具有較強(qiáng)宿主選擇性，一種噬菌體能選擇性的消滅特定致病菌，一般采用裂解性噬菌體用于治療細(xì)菌感染，目前隨著多重抗生素耐藥超級(jí)細(xì)菌的出現(xiàn)，噬菌體療法越來越受關(guān)注。

1.1 噬菌體載體藥物

利用裂解性噬菌體對(duì)抗細(xì)菌感染源于Felix d’Herelle的研究，與抗生素不同，噬菌體種類繁多，病原菌對(duì)一種噬菌體產(chǎn)生抗性后能很快找到替代者。噬菌體療法在波蘭有較長(zhǎng)的歷史，對(duì)該國(guó)的噬菌體療法評(píng)估結(jié)果顯示，153名攜帶耐藥性致病菌的患者中，40%患者癥狀得到改善，18%患者達(dá)到臨床康復(fù)標(biāo)準(zhǔn)[3]。在俄國(guó)，噬菌體療法是一種常規(guī)治療手段，各藥店都有Microgen制藥公司生產(chǎn)的各種抗感染的噬菌體非處方藥物出售[2]。自抗生素發(fā)現(xiàn)后，歐美國(guó)家放棄噬菌體療法，目前，隨著全球性的抗生素耐藥菌日趨嚴(yán)重，西方國(guó)家正加大噬菌體療法研究的投入，例如歐盟于2013年成立Phagoburn項(xiàng)目，開發(fā)治療燒傷的噬菌體療法[4]。

噬菌體是自然界中種類最多的生物體，從宿主菌豐富的環(huán)境中可以分離出各種對(duì)該細(xì)菌具有侵染作用的噬菌體[5,6]。但并非所有這些噬菌體都適于開發(fā)活體藥物，作為治療藥物的噬菌體需具備快速殺死宿主菌的能力，能夠侵染致病菌的各變異亞種，具有穩(wěn)定的基因組，能快速繁殖，對(duì)pH變化穩(wěn)定，易于包裝和長(zhǎng)期儲(chǔ)存，不引起自身免疫反應(yīng)等[7]。此外，由于噬菌體識(shí)別的細(xì)菌表面受體不同，一些噬菌體能夠侵染多種細(xì)菌(廣譜)，一些噬菌體只對(duì)特定的細(xì)菌具有殺滅作用(專一)，在感染病原菌的治療前，專一性噬菌體藥物的開發(fā)可采用逐步篩選的方法，以對(duì)一種噬菌體產(chǎn)生抗性的菌株為靶標(biāo)，篩選出能侵染該菌株的新噬菌體，循環(huán)篩選，直到最后一輪產(chǎn)生的噬菌體抗性菌株對(duì)最初的噬菌體敏感，將這些噬菌體制成混合噬菌體藥物，用于治療耐多種噬菌體藥物的細(xì)菌感染[8]。

利用現(xiàn)代生物技術(shù)能夠快速鑒別和篩選出適于臨床治療的噬菌體。其中一種方法是用電子顯微鏡觀察噬菌體的形態(tài)，鑒別噬菌體種類，選取烈性噬菌體作為候選藥物，該方法同時(shí)可用于檢測(cè)噬菌體儲(chǔ)存藥物的質(zhì)量[7]。另一種方法是基因組測(cè)序，通過噬菌體功能基因組分析，選擇適于疾病治療的噬菌體，能高效感染宿主菌的噬菌體有以下特點(diǎn)：1. 表達(dá)DNA依賴的RNA聚合酶，能快速復(fù)制，并抑制宿主菌的轉(zhuǎn)錄；2. 具有相對(duì)簡(jiǎn)單的結(jié)構(gòu)，不形成溶原狀態(tài)；3. 不含有基因整合酶和轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白，為烈性噬菌體；4. 表達(dá)裂解酶和聚合物解聚酶，能有效識(shí)別和裂解宿主細(xì)胞[7]。

噬菌體進(jìn)入人體后，會(huì)被體內(nèi)天然和獲得性的免疫反應(yīng)消除，這是影響噬菌體療法療效最主要的因素。有研究表明無論何種給藥方式，噬菌體都能進(jìn)入人體循環(huán)系統(tǒng)，同時(shí)會(huì)降低人體對(duì)病原菌的天然免疫防御[9,10]，因此，每種用于免疫治療的噬菌體都需要進(jìn)行免疫反應(yīng)測(cè)試。為提高噬菌體療法的抗菌活性，用于臨床治療的每劑噬菌體藥物都含有多種噬菌體。此外，噬菌體的繁殖需要時(shí)間，在傳染性病原菌爆發(fā)時(shí)期，噬菌體療法的效果不顯著，需要以抗生素治療為主[11]。

為提高噬菌體藥物的藥效，通過分子生物學(xué)手段加強(qiáng)噬菌體對(duì)病原菌的裂解效果。噬菌體會(huì)產(chǎn)生促進(jìn)細(xì)胞裂解的蛋白質(zhì)，例如抑制肽聚糖合成的Amurins，降解肽聚糖的Endolysins和孔道蛋白Holins[12]，讓噬菌體攜帶外源裂解酶(例如Gp17和PlySs2)，以增強(qiáng)其的殺菌效果[13]。讓噬菌體攜帶感光劑tin(IV) chlorin e6 (SnCe6)，在紅光激發(fā)下殺滅靶細(xì)菌[14]。采用脂質(zhì)體包埋的方法增長(zhǎng)噬菌體在體內(nèi)的半衰期，保證噬菌體到達(dá)病灶部位[15]。噬菌體對(duì)宿主具有較強(qiáng)選擇性，因此常規(guī)噬菌體療法對(duì)一些病人無效，為此Eliava研究所推出了個(gè)性化治療方案，用患者的病原菌，從噬菌體庫中篩選針對(duì)該病原菌的噬菌體藥物[16]，由于制備周期長(zhǎng)，該藥物適用于慢性疾病(例如慢性胃腸疾病)的治療。針對(duì)耐藥性的病原菌，采用攜帶CRISPR/Cas基因編輯系統(tǒng)的噬菌體，對(duì)耐藥菌的抗性基因進(jìn)行剪切，達(dá)到定向殺滅耐藥菌的目的[17,18]。細(xì)菌耐藥基因一般是質(zhì)粒攜帶的，采用質(zhì)粒依賴性的噬菌體，例如噬菌體PRD1，特異性的殺滅耐藥性的大腸埃希菌和沙門菌[19]。噬菌體與抗生素聯(lián)合用藥，能增強(qiáng)殺菌效果，例如噬菌體SBW25F2與卡那霉素聯(lián)合使用，能降低熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)耐藥性的出現(xiàn)[20]。

1.2 人源病毒載體藥物

病毒通過識(shí)別靶細(xì)胞表面受體進(jìn)入細(xì)胞，選擇能進(jìn)入特定人體細(xì)胞和組織的病毒作為載體，攜帶用于疾病治療的基因，能達(dá)到靶向治療的目的。目前，具有作為疾病治療的病毒載體有腺病毒相關(guān)病毒(AAV)、慢病毒、腺病毒、和豆病毒。

腺病毒相關(guān)病毒(AAV)屬于細(xì)小病毒科，需要借助輔助病毒(如腺病毒)完成復(fù)制。AAV是一種人類自身攜帶的非致病性病毒，不會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生免疫反應(yīng)[22]，因此可以直接用于體內(nèi)細(xì)胞侵染，在細(xì)胞中可以以游離的形式存在，但具有較長(zhǎng)的外源基因表達(dá)周期，通過AAV瞬時(shí)表達(dá)外源基因，是目前基因治療的標(biāo)準(zhǔn)方法。AAV最大的載容量為3kb，能夠浸染多種細(xì)胞和組織[21]?；贏AV載體的基因治療已經(jīng)進(jìn)入臨床應(yīng)用。例如：世界上首個(gè)基因治療藥物阿利潑金(Glybera)，是由AAV1攜帶人源脂蛋白脂肪酶基因，通過肌肉注射治療脂蛋白脂肪酶缺乏遺傳病[23]，是目前最昂貴的藥物。由AAV2攜帶 RPE65(視網(wǎng)膜發(fā)色團(tuán)異構(gòu)酶)基因用于治療Ⅱ型先天黑蒙癥(LCA2)[24]，已經(jīng)進(jìn)入三期臨床試驗(yàn)階段。此外，基于AAV治療血友病B、內(nèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、囊性纖維癥、無脈絡(luò)膜、肌肉萎縮、抗胰蛋白酶缺乏癥、重度心力衰竭和帕金森等疾病的基因藥物已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段[25]。

慢病毒是一類潛伏期長(zhǎng)的反轉(zhuǎn)錄病毒，具有較大的外源基因容量(18kb)，被廣泛用于基因治療。慢病毒載體在基因組上的整合位點(diǎn)相對(duì)隨機(jī)，較傾向于轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)域，但病毒基因在基因組上的整合會(huì)引起甲基化或表觀遺傳修飾，因此外源基因的表達(dá)水平差別較大[26,27]。慢病毒載體常用于體外侵染細(xì)胞然后再植入體內(nèi)，可用于造血細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)[25]?；诼《据d體的基因治療正進(jìn)入臨床試驗(yàn)，例如：攜帶β-球蛋白基因的慢病毒載體，用于治療β-地中海貧血癥[28]；攜帶脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)子編碼基因abcd1的慢病毒載體，用于治療X染色體連鎖的腎上腺腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良(ALD)[29]；以及用攜帶效應(yīng)基因的慢病毒載體治療慢性淋巴細(xì)胞白血病、B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病和異染性腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良等疾病[25]。

牛痘病毒載體具有較大的外源DNA容量，且無須整合到宿主基因組中，能通過血管傳播，因此能用于轉(zhuǎn)移性腫瘤的治療。攜帶粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-GSF)的牛痘病毒載體，對(duì)黑色素瘤、肝癌、肺癌、結(jié)腸直腸癌、卵巢癌、甲狀腺癌、胰腺癌和胃癌都具有療效[30,31]。利用只能在癌癥細(xì)胞中繁殖的人工牛痘病毒載體，攜帶黑色素合成基因-酪氨酸酶和酪氨酸酶相關(guān)蛋白合成基因，用于癌癥治療。被該病毒侵染的癌細(xì)胞將表達(dá)黑色素，利用黑色吸熱原理，用激光對(duì)腫瘤進(jìn)行溫?zé)嶂委焄32]。

腺病毒是雙鏈DNA病毒，宿主范圍廣，轉(zhuǎn)化效率高，且具有較大外源DNA容量，無須整合到宿主基因組中。但腺病毒具有較強(qiáng)免疫原性，能引起宿主較強(qiáng)的免疫應(yīng)答反應(yīng)，因此主要用作疫苗載體，例如：攜帶H5N1和H1N1抗原的腺病毒載體，口服用于預(yù)防H5N1和H1N1型流感病毒，臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示具有療效[33]。

2 病毒載體藥物的表達(dá)系統(tǒng)

微生物工程菌株應(yīng)用于疾病治療時(shí)，其效應(yīng)物分子表達(dá)的時(shí)間、空間和表達(dá)水平?jīng)Q定了該藥物的療效。例如，為增強(qiáng)病毒對(duì)腫瘤細(xì)胞的侵染效率，在病毒的外殼上表達(dá)能與腫瘤細(xì)胞結(jié)合的抗體亞基Fab或其它能與腫瘤細(xì)胞結(jié)合的多肽，保證病毒在腫瘤細(xì)胞中的富集，同時(shí)采用腫瘤或癌細(xì)胞特異的啟動(dòng)子(端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶啟動(dòng)子hTERT，低氧誘導(dǎo)啟動(dòng)子E2F-1和α-甲胎蛋白AFP啟動(dòng)子等)調(diào)控效應(yīng)物分子表達(dá)，保證藥物分子只在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)[34]。為維持細(xì)胞內(nèi)藥物與底物的平衡，采用底物誘導(dǎo)型啟動(dòng)子調(diào)控效應(yīng)物分子表達(dá)，例如用人工合成的脂肪酸誘導(dǎo)啟動(dòng)子PPARα-TtgR表達(dá)減肥藥普蘭林肽，用于肥胖病的治療[35]。

為保證藥物分子能持續(xù)發(fā)揮療效，構(gòu)建具有信號(hào)儲(chǔ)存能力的工程菌，可以在疾病信號(hào)分子瞬時(shí)表達(dá)過后，仍能起到持續(xù)治療作用。例如，采用噬菌體的位點(diǎn)特異性整合系統(tǒng)，該系統(tǒng)被信號(hào)分子觸發(fā)后，在基因特定位點(diǎn)發(fā)生重組，進(jìn)而改變效應(yīng)物調(diào)控系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)，達(dá)到組成型表達(dá)效應(yīng)物分子的目的[36]，此外，還可以采用轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)儲(chǔ)存信號(hào)，當(dāng)效應(yīng)物分子被觸發(fā)表達(dá)后，沒有誘導(dǎo)物的情況下也能持續(xù)表達(dá)[36]。為避免人體對(duì)外源效應(yīng)物的免疫排斥，采用RNA等非蛋白類物質(zhì)為效應(yīng)物用于基因治療[37]。

3 結(jié)論與展望

天然病毒對(duì)其靶細(xì)胞具有殺滅作用，但作用強(qiáng)度及時(shí)效性無法控制，使其醫(yī)用價(jià)值受限。根據(jù)病毒對(duì)靶細(xì)胞的選擇性，以及病毒能作為DNA載體將外源基因轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞中的特性，選擇特殊的病毒作為外源治療基因的載體，將具有疾病治療作用的分子導(dǎo)入特定的組織、細(xì)胞或細(xì)菌中表達(dá)，能達(dá)到靶向治療或定向殺菌的效果。該技術(shù)不僅可以用于遺傳疾病的基因治療，還能用于開發(fā)替代傳統(tǒng)化學(xué)藥物的活體微生物藥物，對(duì)醫(yī)藥發(fā)展具有重要的推動(dòng)作用。

隨著新一代測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，測(cè)序效率不斷提高以及測(cè)序成本的不斷下降，使得通過全基因組測(cè)序分析患者的基因缺陷成為可能，也為個(gè)性化基因治療奠定了基礎(chǔ)。但是出于安全性考慮和其天價(jià)的治療費(fèi)用，目前大部分基因治療都處于動(dòng)物試驗(yàn)階段。全球首個(gè)基于AAV的基因治療藥物Glybera(治療脂蛋白脂酶缺陷癥)在歐盟上市3年后，出于成本的考慮于2017年10月退出市場(chǎng)[38]。2016年5月全球第二個(gè)基因治療藥物Strimvelis(治療腺苷脫氨酶ADA缺乏性重度免疫缺陷癥)在歐洲上市，Strimvelis基因治療，通過逆轉(zhuǎn)錄病毒(retrovirus)在體外將一個(gè)正常的ADA基因拷貝導(dǎo)入患者干細(xì)胞中，然后將修飾后的干細(xì)胞定植到患者骨髓，達(dá)到一次治療終生治愈的目的，極大的降低了治療費(fèi)用[38]，盡管如此，但65萬美元的治療費(fèi)用一般患者無法承擔(dān)。目前，熱門的新型生物技術(shù)CAR-T(嵌合抗原受體T細(xì)胞)療法與Glybera療法類似，通過體外改造人體T細(xì)胞，讓其攜帶識(shí)別特定腫瘤抗原的嵌合抗原受體基因，然后將修飾后的T細(xì)胞導(dǎo)入患者體內(nèi)，用于白血病和腫瘤的治療[39]，由于CAR-T療法具有更廣的患者群體，其價(jià)格稍低于Glybera療法。目前有兩款CAR-T產(chǎn)品被美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市，Kymriah(2017年8月)用于治療急性淋巴細(xì)胞白血病和慢性大B細(xì)胞淋巴瘤，Yescarta(2017年10月)用于治療大B細(xì)胞淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，此外還有大量CAR-T產(chǎn)品處于臨床前試驗(yàn)階段[39]。我國(guó)CAR-T產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，自2017年12月起南京傳奇、上海明聚生物和上海恒潤(rùn)達(dá)生等多家企業(yè)陸續(xù)申報(bào)了CAR-T 細(xì)胞臨床試驗(yàn)。 2015年至今，我國(guó)CAR-T療法專利呈直線增長(zhǎng)[40]。但目前CAR-T療法副作用明顯，國(guó)內(nèi)外均出現(xiàn)多起CAR-T致死案例，因此CAR-T細(xì)胞構(gòu)建方法及抗原靶點(diǎn)的選擇有待進(jìn)一步優(yōu)化，病毒基因載體技術(shù)的發(fā)展是其重要環(huán)節(jié)。

傳統(tǒng)化學(xué)藥物在人類的健康及農(nóng)業(yè)發(fā)展史上具有重要作用，但是隨著化學(xué)農(nóng)藥和抗生素的廣泛使用，農(nóng)藥污染和抗生素耐藥性問題越來越突出，病蟲害的生物防治和抗生素替代療法逐漸受到重視。2015年美國(guó)開始采取抗生素替代計(jì)劃，逐步減少抗生素的使用，其中重要的舉措就是批準(zhǔn)噬菌體制劑在食品和飼料添加劑中使用[41]，同時(shí)，國(guó)外許多藥企開始聚焦噬菌體療法的研發(fā)和推廣，例如：以色列一家微生物菌群治療公司BiomX2017年融資2400萬美元，開發(fā)定制的噬菌體療法用于根除痤瘡和炎癥性腸病相關(guān)的有害細(xì)菌；美國(guó)兩家初創(chuàng)公司AmpliPhi生命科技公司和Adpitive Phage治療公司都致力于開發(fā)代替抗生素治療的實(shí)用噬菌體治療方案。我國(guó)是抗生素濫用最為嚴(yán)重的國(guó)家之一，2016年國(guó)家開始實(shí)施細(xì)菌耐藥國(guó)家行動(dòng)計(jì)劃(2016—2020)，逐步淘汰抗生素在飼料添加劑中的使用。近年來，噬菌體療法的研究發(fā)展迅猛，國(guó)內(nèi)相繼成立了“國(guó)際噬菌體研究中心”(2014年11月)，“上海噬菌體與耐藥研究所”(2017年8月)，“國(guó)際噬菌體藥物研究中心”(2017年10月)，和“中英噬菌體合作研發(fā)實(shí)驗(yàn)室”(2018年8月)。與西方國(guó)家相比，我國(guó)缺少參與噬菌體療法研究的大型藥企，這些大型藥企在噬菌體療法中的創(chuàng)新研究將極大推動(dòng)我國(guó)噬菌體療法的發(fā)展。