F11 rs2289252基因多態(tài)性與急性白血病患者出血相關(guān)性分析

董 娟 陳永玲 鄒惠安 李 滔 梅 冰

急性白血病(Acute Leukemia，AL)是一種惡性血液系統(tǒng)疾病，常見的臨床表現(xiàn)有瘀斑、牙齦出血、鼻出血等。AL患者中凝血及血栓性問題危及患者生命，故對患者出血的預(yù)防及預(yù)測尤為重要。凝血因子Ⅺ(F11)基因定位于4號染色體，編碼凝血因子Ⅺ，F(xiàn)11在凝血級聯(lián)反應(yīng)中具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)F11 rs2289252多態(tài)性與血漿F11水平相關(guān)[1]。F11 rs2289252在AL中表達如何，目前尚未見報道。本研究檢測分析了AL 患者[急性淋巴細胞白血病(ALL)、急性髓細胞白血病(AML)]和健康對照者rs2289252 基因位點單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)，探討rs2289252基因多態(tài)性與AL患者出血之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對象

2016-09—2018-09在荊州市中心醫(yī)院確診AL患者90例，其中AML患者70例(AML組，男37例，女33例，年齡41.34±15.01歲)，ALL患者20例(ALL組，男10例，女10例，年齡42.17±15.32歲)。所有患者均經(jīng)骨髓細胞形態(tài)學、免疫學分型、流式細胞學檢測，符合《血液病診斷及療效標準》[2]。根據(jù)入院時有無出血癥狀將AML和ALL患者分為出血組(表現(xiàn)為皮膚瘀點瘀斑、牙齦出血、鼻腔出血、眼底出血、尿紅細胞陽性、糞隱血試驗陽性、肉眼血尿、黑便、顱內(nèi)出血等)和未出血組兩個亞組。選取同期體檢健康者104例作為對照組，男59例，女45例，平均年齡42.95±15.23歲。所有受試者確診前均未服用影響凝血及血液系統(tǒng)的藥物，無肝、腎疾病史、感染性疾病史及家族血栓病史。AML組、ALL組與對照組間性別、年齡差異均無統(tǒng)計學意義(χ2=0.308，F(xiàn)=0.288，P>0.05)，具有可比性。

1.2 主要設(shè)備和耗材

XN-3000型全自動血液分析儀(日本Sysmex公司)、ACL-TOP型全自動凝血分析儀(美國IL公司)、東勝龍ETC 811 PCR儀(北京東勝創(chuàng)新生物科技公司)；JY3000電泳儀(北京君意東方電泳設(shè)備公司)；BioDoc-it凝膠成像系統(tǒng)(美國UVP公司) ；超微量核酸分析儀(英國BioDrop公司)；TaKaRa Ex Taq PCR反應(yīng)試劑盒(大連寶生物工程公司)；QIAamp DNA Blood Mini Kit核酸提取純化試劑盒(德國QIAGEN公司)，Gel Red核酸染料(美國Biotium公司)，DL 1000 DNA Marker(大連寶生物工程公司)，其它試劑均為廠家配套試劑。

1.3 引物合成

根據(jù)NCBI提供的F11 rs2289252位點前后約250bp序列，利用primer 5軟件在線設(shè)計引物，上游引物：5’-ACT TAT TTT GGG AAT GTG GGT-3’，下游引物：5’-GGT TCC GCT CTT CAT TTC TAG-3’，擴增片段大小為569bp，由上海生工生物公司合成。

1.4 檢測方法

所有受試者均在清晨空腹采集靜脈血1.8ml置于含有109mmol/L枸櫞酸鈉抗凝真空管中，充分顛倒混勻、離心，全自動凝血分析儀檢測凝血指標，包括纖維蛋白原(FIB)、血漿凝血酶原時間(PT)、活化部分凝血活酶時間(APTT)和凝血酶時間(TT)。同時，采集所有受試者靜脈血2ml置于含EDTA-K2抗凝劑的抗凝管中，充分混勻，取200μl置于1.5ml EP管中，用QIAGEN公司提供的核酸提取純化試劑盒提取基因組DNA，提取方法按試劑說明書進行，測定提取后DNA的濃度和純度，于-80℃保存。剩余全血采用全自動血液分析儀完成血常規(guī)的檢測，包括白細胞計數(shù)(WBC)、紅細胞計數(shù)(RBC)、血紅蛋白(Hb)和血小板計數(shù)(PLT)。

1.5 PCR擴增及基因多態(tài)性檢測

rs2289252位點PCR反應(yīng)體系為25μl，包含10×Ex Taq Buffer 2.5μl，dNTP Mixture 2μl，Taq酶0.125μl，上游引物(20μmol/L)0.625μl，下游引物(20μmol/L)0.625μl，滅菌蒸餾水17.125μl，DNA模板2μl(約100ng)；rs2289252位點擴增條件為：95℃ 30s；95℃ 10s，58.8℃ 30s，72℃ 45s，循環(huán)30次。取5μl PCR擴增產(chǎn)物用含Gel Red核酸染料的2%瓊脂糖凝膠電泳驗證擴增產(chǎn)物特異性，剩余PCR擴增產(chǎn)物送上海生工生物公司進行測序。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 各組血常規(guī)、凝血指標水平比較

各組WBC、RBC、Hb、PLT、FIB水平差異有統(tǒng)計學意義。與對照組比較，AML組和ALL組WBC和FIB 水平均升高，RBC、Hb、PLT水平均降低，且AML組各指標異常更明顯，差異均有統(tǒng)計學意義(t均>3.363，P均<0.01)。各組PT、APTT、TT水平差異無統(tǒng)計學意義。見表1。

表1 各組血常規(guī)、凝血指標比較

2.2 F11 rs2289252位點多態(tài)性分布

采用Sanger法檢測F11 rs2289252多態(tài)性位點基因型，測序圖譜見圖1?；蛐皖l率符合Hardy-Wenberg平衡，樣本具有群體代表性。各組rs2289252位點CC、TC、TT基因型差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。各組rs2289252等位基因頻率在間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

圖1 F11 rs2289252位點的測序圖譜

表2 AML組、ALL組及對照組 rs2289252位點基因型及等位基因頻率的比較(n，%)

2.3 出血與未出血AL患者F11 rs2289252位點基因多態(tài)性

AML患者中，出血組與未出血組患者rs2289252位點基因型和等位基因頻率差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，出血組CC基因型頻率高于未出血組，TT、TC基因型頻率低于未出血組(P<0.05)；出血組T等位基因頻率低于未出血組(P<0.05)。ALL患者中，出血組與未出血組患者rs2289252位點基因型和等位基因頻率差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 未出血患者與出血患者基因型和等位基因頻率的比較(n，%)

2.4 AML患者出血與rs2289252位點基因多態(tài)性多元Logistic回歸分析

通過排除性別、年齡、PLT等干擾因素的多元Logistic回歸分析rs2289252位點與AML患者出血易感性，結(jié)果顯示，rs2289252 TC基因型患者出血的風險是CC型的0.256倍，見表4。

表4 F11 rs2289252基因型與AML患者出血風險的關(guān)聯(lián)

3 討 論

皮膚瘀斑或出血是AL患者常見的臨床癥狀。AL與止血系統(tǒng)有關(guān)，部分患者臨床表現(xiàn)為出血，少數(shù)患者也有靜脈血栓(VTE)、肺栓塞(PE)、彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)等表現(xiàn)，也可有出血和血栓并發(fā)癥的危險。WBC增加與FIB降解產(chǎn)物增多是初發(fā)AL早期顱內(nèi)出血的危險因素[3]。研究表明PLT減少使患者有更高的出血風險[4]。對本研究對象一般資料比較表明，AML組和ALL組WBC、FIB水平較對照組明顯升高，RBC、Hb、PLT水平明顯降低。血液病患者由于伴隨PLT減少而具有非常高的出血性風險。傳統(tǒng)的凝血試驗如PLT、PT、FIB、APTT、TT等對患者凝血功能的判斷仍有局限性[5]。因此，從遺傳學角度預(yù)估AL患者出血風險對臨床治療至關(guān)重要。

F11的凝血功能既可以通過組織因子途徑抑制物(TFPI)的失活促進凝血酶生成，也可以通過凝血酶反饋激活F11進一步放大外源性凝血途徑[6]。F11最初被描述為接觸激活通路的一個成員，與凝血因子7、組織因子一起導致凝血酶產(chǎn)生，隨后在血管損傷時形成血栓。本研究通過分析各組F11 rs2289252基因多態(tài)性結(jié)果表明，各組rs2289252位點CC、TC、TT基因型差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。各組rs2289252等位基因頻率差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。有研究發(fā)現(xiàn)F11 rs2289252與妊娠晚期靜脈血栓形成相關(guān)[7]。拉脫維亞人群中，F(xiàn)11 rs2289252多態(tài)性是深靜脈血栓形成的重要遺傳學標記，可評估和預(yù)防深靜脈血栓的風險[8]。有研究對位于CYP4V2基因附近F11基因進行了基因分型，確定了F11基因的rs2289252與深靜脈血栓有關(guān)聯(lián)[9-10]。這些研究為F11在血栓形成過程中的作用提供了支持，并且F11缺乏癥患者會有輕度出血表現(xiàn)，F(xiàn)11作為抗凝治療的潛在靶點，可能降低出血的風險，近年來受到了廣泛的關(guān)注[11]。目前F11被認為在產(chǎn)生持續(xù)凝血酶和穩(wěn)定血栓形成方面起著重要的作用?；贔11在凝血功能中的作用，F(xiàn)11編碼基因的多態(tài)性可能與AL患者出血的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。AML患者中，出血組與未出血組患者rs2289252位點基因型和等位基因頻率差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，出血組CC基因型頻率高于未出血組，TT、TC基因型頻率低于未出血組(P<0.05)；出血組T等位基因頻率低于未出血組(P<0.05)。ALL患者中，出血組與未出血組患者rs2289252位點基因型和等位基因頻率差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

目前，越來越多的研究集中在SNP上[12]。El-Galaly等人復(fù)制全基因組關(guān)聯(lián)研究結(jié)果后，發(fā)現(xiàn)rs2289252 TT基因型與靜脈血栓栓塞的風險顯著相關(guān)[7]。有Meta分析顯示， F11 rs2289252 TT基因型是共同顯性模型VTE易感性的危險因素[13]。血栓與出血的發(fā)生與凝血因子的產(chǎn)生及活性紊亂相關(guān)，受相關(guān)遺傳因素的影響。研究發(fā)現(xiàn)rs2289252 T等位基因是F11活性較高的預(yù)測因子[14]。本研究通過Sanger測序法檢測F11 rs2289252 位點基因型發(fā)現(xiàn)AML組未出血組 rs2234237 位點的 T 等位基因頻率高于出血組(44.68% vs 26.09%，P=0.034)，提示rs2234237位點的多態(tài)性改變可能與AML出血發(fā)生有關(guān)；ALL組F11 rs2289252位點等位基因頻率在未出血組與出血組間的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。通過排除性別、年齡、PLT等干擾因素的多元Logistic回歸方法分析rs2289252位點的多態(tài)性對AML出血風險評估后發(fā)現(xiàn)，TC基因型與AML患者出血風險呈負相關(guān)，F(xiàn)11 rs2289252 T等位基因可能是AML患者出血保護因素。

遺傳因素有著顯著的地域及種族差異，本研究收集的病人均來自荊州地區(qū)漢族人群，樣本量較少，因此，下一步還需加大樣本量，以進一步明確凝血相關(guān)基因多態(tài)性與AL患者出血的關(guān)系。