異丙腎上腺素下調(diào)NADPH氧化酶負(fù)調(diào)控瘦素表達(dá)加劇db/db小鼠心功能異常

陳 鵬 王 萍

隨著現(xiàn)代社會(huì)生產(chǎn)和生活方式的改變及人口老齡化的加劇，糖尿病的發(fā)生率和死亡率呈逐年升高趨勢(shì)[1，2]。糖尿病心肌病是糖尿病最常見(jiàn)的并發(fā)癥，嚴(yán)重威脅患者的生存狀態(tài)和生活質(zhì)量。糖尿病心肌病的發(fā)生與多種因素相關(guān)，如應(yīng)激性刺激[3，4]，但是其確切的發(fā)病機(jī)制尚不明確。異丙腎上腺素是β受體激動(dòng)劑，臨床上多用于支氣管哮喘和心臟房室傳導(dǎo)阻滯。但同時(shí)，使用異丙腎上腺素可能引起心動(dòng)過(guò)速、心律失常和心悸等，甚至引起心絞痛，加劇心臟損傷，但是其確切的發(fā)病機(jī)制尚不清楚?？蒲杏?型糖尿病db/db小鼠是目前研究糖尿病發(fā)病機(jī)制及藥物治療的重要模型[5-7]。已有證據(jù)表明氧化應(yīng)激與幾種心肌病動(dòng)物模型有關(guān)[8-10]。本研究探討瘦素異常表達(dá)在異丙腎上腺素引起的心臟功能障礙中的作用以及NADPH氧化酶的改善作用，為相關(guān)新藥開(kāi)發(fā)和治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑和儀器

野生型小鼠和db/db小鼠均購(gòu)自上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；Anti-p22phox (sc-271968)、 Anti-p47phox (sc-365215)、Anti-p67phox (sc-374510)、Anti-gp91 (sc-130543)均購(gòu)自Santa Cruz公司, Anti-基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)2 (ab80737)、Anti-MMP9 (ab38898)、Anti-leptin (ab3583)、Anti-TIMP1/2 (ab3625) 均購(gòu)自Abcam公司，羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)，NADPH氧化酶抑制劑apocynine購(gòu)自Sigma Aldrich公司(粉末，純度≥98%，采用生理鹽水配置成100mg/ml實(shí)驗(yàn)濃度)。脫色搖床及轉(zhuǎn)膜儀購(gòu)自北京六一儀器廠；樣品保存箱和超低溫冰箱為海爾集團(tuán)產(chǎn)品；垂直電泳儀及凝膠成像儀購(gòu)自美國(guó)BioRad公司。所有操作均符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例的要求。

1.2 動(dòng)物分組及處理

db/db小鼠和野生型小鼠均隨機(jī)分為3組：對(duì)照組、異丙腎上腺素組和NADPH氧化酶抑制劑apocynin組(n均=6)。異丙腎上腺素組和apocynin組小鼠給予異丙腎上腺素(1mg/kg)皮下注射，連續(xù)6天，對(duì)照組小鼠給予等量生理鹽水注射。apocynin組小鼠從第4天起給予apocynin (100mg/kg)灌胃治療，對(duì)照組和異丙腎上腺素組小鼠給予等劑量的CMC-Na (100mg/kg)灌胃。6天后檢測(cè)以下指標(biāo)。

1.3 小鼠心功能指標(biāo)檢測(cè)

主要計(jì)算左心室重量指數(shù)，連續(xù)測(cè)出3個(gè)心搏舒張末左室內(nèi)徑、舒張末室間隔厚度、左室后壁厚度，得出平均值，然后采用Deiereux的心室重量校正公式校正左心室重量，再進(jìn)一步計(jì)算左心室重量指數(shù)。

1.4 Western Blotting檢測(cè)NADPH 氧化酶亞基、瘦素及MMP和TIMP1/2蛋白表達(dá)

小鼠腹腔注射20%烏拉坦(0.5ml/100g)進(jìn)行麻醉，脫臼處死并分離心臟組織。提取小鼠左心室總蛋白，采用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行總蛋白的定量。在各個(gè)點(diǎn)樣孔中以等量蛋白進(jìn)行10%的十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳和半干法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。然后將醋酸纖維素膜用5.0%的脫脂牛奶封閉1h。纖維素膜封閉后與一抗4℃雜交過(guò)夜，無(wú)菌PBS漂洗3次后與辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記二抗室溫反應(yīng)后進(jìn)行顯色、拍照。用凝膠成像分析系統(tǒng)測(cè)定光密度，以β-actin為內(nèi)參進(jìn)行蛋白的相對(duì)定量分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 apocynine改善異丙腎上腺素引起的左心室異常

不論是野生型小鼠還是db/db型小鼠，多組間左心室重量指數(shù)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=32.545，46.587，P<0.01)，與同型小鼠對(duì)照組比較，異丙腎上腺素組小鼠左心室重量指數(shù)均明顯升高(t=1.435，2.433，P<0.01)，而apocynine組較異丙腎上腺組明顯改善(t=2.453,2.067，P<0.05)，見(jiàn)圖1。

注：與對(duì)照組比較，*P< 0.01；與異丙腎上腺組比較，#P< 0.01；與同組野生型小鼠比較，△P<0.05

2.2 apocynine改善異丙腎上腺素引起瘦素蛋白的異常表達(dá)

不論是野生型小鼠還是db/db小鼠，多組間瘦素蛋白的表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=32.765，49.023，P<0.01)，與同型對(duì)照組小鼠比較，異丙腎上腺素引起野生型和db/db型小鼠瘦素表達(dá)顯著降低(t>4.435，P<0.01)，而apocynin組小鼠上述異常明顯恢復(fù)(P<0.01)，見(jiàn)圖2。

注：與對(duì)照組比較，*P< 0.01；與異丙腎上腺組比較，#P< 0.01；與同組野生型小鼠比較，△P<0.05

2.3 apocynine改善異丙腎上腺素引起的NADPH 氧化酶亞基異常表達(dá)

不論是野生型小鼠還是db/db型小鼠，多組間NADPH氧化酶亞基p22phox、p47phoox、p67phox和 gp91差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F均>29.753，P<0.01)。與對(duì)照組比較，異丙腎上腺素組小鼠NADPH 氧化酶亞基p22phox、p47phoox、p67phox和 gp91表達(dá)顯著升高(t均>2.234，P<0.01)，而apocynine組較異丙腎上腺組明顯改善(t均>2.450,P<0.01)，見(jiàn)圖3。

注：與對(duì)照組比較，*P<0.01；與異丙腎上腺組比較，#P<0.01；與同組野生型小鼠比較，△P<0.05

2.4 apocynine改善異丙腎上腺素引起的MMP異常表達(dá)

不論是野生型小鼠還是db/db型小鼠，多組間MMP2、MMP9、TIMP1和TIMP2表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F均>34.341，P<0.01)。與對(duì)照組比較，異丙腎上腺素組小鼠MMP2、MMP9、TIMP1、TIMP2表達(dá)顯著升高(t均>3.398，P<0.01)，而apocynine組較異丙腎上腺組明顯改善(t均>4.185，P<0.01)，見(jiàn)圖4。

注：與對(duì)照組比較，*P<0.01；與異丙腎上腺組比較，#P<0.01；與同組野生型小鼠比較，△P<0.01

3 討 論

糖尿病心肌病是糖尿病最常見(jiàn)的大血管并發(fā)癥之一，嚴(yán)重威脅著患者的生存狀態(tài)。但目前關(guān)于糖尿病心肌病的發(fā)病機(jī)制尚不明確。β受體的激活參與了心律失常的惡化及心臟功能的異常過(guò)程。本研究發(fā)現(xiàn)異丙腎上腺素組小鼠存在明顯的心功能異常，且NADPH氧化酶亞基p22phox、p47phox、p67phox、gp91phox及瘦素表達(dá)明顯升高，MMP2/9和TIMP1/2也明顯升高，且db/db小鼠變化比野生型小鼠變化明顯，表明異丙腎上腺素通過(guò)下調(diào)NADPH氧化酶負(fù)調(diào)控的瘦素表達(dá)加劇db/db小鼠心肌功能異常。

以往的研究發(fā)現(xiàn)MMPs及其抑制劑調(diào)控了心肌纖維化及糖尿病并發(fā)癥和心律失常的病理過(guò)程[11，12]。MMPs的異常表達(dá)導(dǎo)致了心臟結(jié)構(gòu)的異常和心肌細(xì)胞內(nèi)電信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的異常[13，14]。本研究中也證實(shí)了MMPs和TIMPs蛋白表達(dá)的異常是異丙腎上腺素引起心肌細(xì)胞損傷的重要機(jī)制。膠原的積聚過(guò)程和MMP表達(dá)的升高與多種因素相關(guān)[15-17]。氧化應(yīng)激過(guò)程是細(xì)胞內(nèi)最常見(jiàn)的病理及生理過(guò)程，且與多種疾病的發(fā)病密切相關(guān)，如糖尿病、心肌病等。本研究也發(fā)現(xiàn)異丙腎上腺素能夠引起NADPH 氧化酶亞基表達(dá)的顯著增強(qiáng)，而apocynine可以有效緩解上述異常，提示NADPH氧化酶調(diào)控的氧化應(yīng)激也與此過(guò)程有關(guān)。

基于上述結(jié)果，本研究推斷異丙腎上腺素惡化db/db小鼠的心功能的過(guò)程中NADPH氧化酶發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，而apocynine是NADPH氧化酶的特異性抑制劑，能夠直接與NADPH氧化酶結(jié)合而發(fā)揮作用，本研究中apocynine為陽(yáng)性對(duì)照藥物，其可以通過(guò)抑制NADPH氧化酶改善小鼠心功能異常。在多種心肌病病理模型中，MMP及其抑制劑調(diào)控的細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)發(fā)揮著重要的作用[18，19]。以往的研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解與重構(gòu)是心臟、腎臟等器官發(fā)生組織纖維化的重要誘因[20，21]。本研究也證實(shí)與對(duì)照組比較，異丙腎上腺素組小鼠心功能存在明顯的異常，且NADPH氧化酶亞基p22phox、p47phox、p67phox、gp91phox及瘦素表達(dá)明顯升高，MMP2/9和TIMP1/2也明顯升高。

綜上所述，本文通過(guò)分析推測(cè)異丙腎上腺素通過(guò)下調(diào)NADPH氧化酶負(fù)調(diào)控的瘦素表達(dá)加劇db/db小鼠心肌功能異常，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。