Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化健脾祛濕丸醇提工藝

依孜提·帕力哈提 張剛 王萍

摘要：目的 ?采用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化健脾祛濕丸的醇提工藝。方法 ?以鹽酸小檗堿、苦參堿含量及浸膏得率的綜合評(píng)分為指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken響應(yīng)面法考察乙醇濃度、加醇倍量和提取時(shí)間對(duì)健脾祛濕丸醇提工藝的影響。結(jié)果 ?最佳提取工藝為：加10倍量60%乙醇，回流提取3次，每次2 h。結(jié)論 ?本試驗(yàn)優(yōu)選的醇提工藝穩(wěn)定、可行，為工業(yè)大生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：健脾祛濕丸;醇提工藝;鹽酸小檗堿;苦參堿;Box-Behnken響應(yīng)面法

中圖分類號(hào)：R283.5 ???文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A??? 文章編號(hào)：1005-5304（2019）02-0084-05

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.02.018

開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract： Objective To optimize the ethanol extraction process of Jianpi Qushi concentrated pills by using Box-Behnken response surface method. Methods On the basis of single factor test， taking the comprehensive scores of content of berberine hydrochloride and matrine and extract yield as indicators， the effects of ethanol concentration， alcohol addition and extraction time on alcohol extraction process were examined by Box-Behnken response surface method. Results The optimal extraction process was adding 10 times amount of 60% ethanol， reflux extracting 3 times and 2 hours each time. Conclusion The optimized ethanol extraction process is stable and predictable， which can lay foundation for industrial production of Jianpi Qushi concentrated pills.

Keywords： Jianpi Qushi concentrated pills; ethanol extraction process; berberine hydrochloride; matrine; Box-Behnken response surface method

健脾祛濕丸處方來(lái)源于新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院皮膚科劉紅霞教授多年臨床實(shí)踐的經(jīng)驗(yàn)方，由黃柏、苦參、白術(shù)、土茯苓等藥組成，具有健脾祛濕、潤(rùn)燥止癢功效，臨床用于脾虛濕盛所致的白疕（尋常型銀屑?。╈o止期及慢性濕疹，證見(jiàn)皮疹斑塊色淡、肥厚浸潤(rùn)，難以消退，反復(fù)發(fā)作，伴有面色不華，舌質(zhì)淡胖。黃柏苦寒，瀉火解毒、清熱燥濕，其主要活性成分為鹽酸小檗堿，含量達(dá)1.4%～5.8%，藥理作用為抗炎、抗菌、免疫抑制、抗?jié)兊?，其抗炎作用主要通過(guò)下調(diào)炎癥介質(zhì)的mRNA表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)^[1-5]。苦參具有清熱解毒、利濕止癢功效?？鄥A為苦參的主要活性成分，具有抗炎、抗過(guò)敏、抗病毒、抗纖維化和免疫抑制等多方面藥理活性，可用于瘙癢性、炎癥性、免疫性等皮膚疾病的治療^[6-10]。健脾祛濕丸原以散劑形式作為醫(yī)院制劑在臨床應(yīng)用多年，使用不便，患者依從性較差，濃縮丸劑在保持散劑療效的同時(shí)能克服以上缺點(diǎn)，并可提高藥物穩(wěn)定性，減少刺激性，遮蓋不良口感，方便患者服用。本試驗(yàn)依據(jù)處方功能、主治及組方藥物的理化性質(zhì)，運(yùn)用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化健脾祛濕丸的醇提工藝，為該制劑工業(yè)大生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1? 儀器與試藥

高效液相色譜儀（Waters 2424、Waters 2996），美國(guó)Waters;SI-234電子天平（d=0.1 mg），丹佛儀器（北京）有限公司;AGL-135型電子天平（d=0.01 mg），瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司;Direct-Q 5型超純水儀，美國(guó)Millipore公司;Dl-820智能超聲波清洗器，上海之信儀器有限公司;DLSB-10/20低溫冷卻液循環(huán)泵，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司;KDM型調(diào)溫電熱套，山東甄城光明儀器有限公司。

鹽酸小檗堿對(duì)照品（批號(hào)110713-201212，純度86.7%）、苦參堿對(duì)照品（批號(hào)110805-200508，純度99.8%），中國(guó)食品藥品檢定研究院。甲醇、乙腈為色譜純（Fisher公司），磷酸等其他試劑均為分析純，超純水。苦參、黃柏、白術(shù)等飲片均購(gòu)于亳州市中正中藥材飲片有限公司，均符合2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》（一部）各藥項(xiàng)下規(guī)定。

2? 方法與結(jié)果

2.1? 鹽酸小檗堿含量測(cè)定

2.1.1? 色譜條件

采用Symmetry Shield C18柱（4.6 mm×150 mm，5 ?m），流動(dòng)相為乙腈∶0.1%磷酸溶液（每1000 mL磷酸溶液加十二烷基磺酸鈉1.0 g）=45∶55，進(jìn)樣量10 μL，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)265 nm^[11]。

2.1.2? 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取適量鹽酸小柏堿對(duì)照品，加流動(dòng)相制成濃度為1.02 mg/mL的鹽酸小檗堿對(duì)照品貯備液。

2.1.3? 供試品溶液的制備

稱取處方中擬醇提的藥物飲片，加10倍量60%乙醇，每次1 h，加熱回流提取2次，合并提取液，取上清液1 mL，轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶，加60%乙醇定容至刻度，過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4? 陰性對(duì)照溶液的制備

按處方量稱取除黃柏以外擬醇提的藥物飲片，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.1.5? 線性關(guān)系考察

精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下對(duì)照品貯備液，加甲醇分別稀釋至0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以峰面積積分值對(duì)質(zhì)量濃度進(jìn)行回歸，得回歸方程Y=37 819 336.69X-163 479.38（r=0.999 5），結(jié)果表明鹽酸小檗堿在2.00～10.00 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.6? 精密度試驗(yàn)

精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下對(duì)照品貯備液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算得鹽酸小檗堿峰面積RSD=0.37%，表明儀器精密度良好。

2.1.7? 重復(fù)性試驗(yàn)

稱取擬醇提藥物飲片，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果鹽酸小檗堿峰面積RSD=1.35%，表明重復(fù)性良好。

2.1.8? 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件分別于制備后0、4、8、12、24、48 h測(cè)定，結(jié)果鹽酸小檗堿峰面積RSD=0.99%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.9? 加樣回收率試驗(yàn)

取鹽酸小檗堿含有量已知的供試品6份，精密加入鹽酸小檗堿對(duì)照品適量，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，結(jié)果平均回收率為100.11%，RSD=1.78%，表明加樣回收率良好。

2.2? 苦參堿含量測(cè)定

2.2.1? 色譜條件

采用Symmetry Shield C18柱（4.6 mm×150 mm，5 ?m），流動(dòng)相為乙腈∶甲醇∶三乙胺∶磷酸鹽緩沖液（pH 6.8）=12∶12∶0.1∶76，進(jìn)樣量10 μL，流速1 mL/min，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm^[12-13]。

2.2.2? 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取適量苦參堿對(duì)照品，加甲醇制成濃度為0.51 mg/mL的苦參堿對(duì)照品貯備液。

2.2.3? 供試品溶液的制備

稱取處方中擬醇提的藥物飲片，加10倍量60%乙醇，回流提取2次，每次1 h，取醇提液30 mL，精密加入三氯甲烷-甲醇-濃氨水（40∶10∶1）混合溶液50 mL并超聲處理30 min，轉(zhuǎn)移至分液漏斗，取下層，蒸干，殘?jiān)蛹状既芙?，定容?0 mL容量瓶，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4? 陰性對(duì)照溶液的制備

按處方量稱取除苦參外擬醇提的藥物飲片，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.2.5? 線性關(guān)系考察

精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品貯備液，加甲醇分別稀釋至0.07、0.14、0.21、0.28、0.35 mg/mL，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以峰面積積分值對(duì)質(zhì)量濃度進(jìn)行回歸，得回歸方程Y=6 950 797.44X-9791.88（r=0.999），結(jié)果表明苦參堿在0.70～3.50 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.6? 精密度試驗(yàn)

精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品貯備液，按“2.2.1” 項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算得苦參堿峰面積RSD=0.63%，表明儀器精密度良好。

2.2.7? 重復(fù)性試驗(yàn)

稱取處方中擬醇提的藥物飲片30 g，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，計(jì)算得苦參堿峰面積RSD=0.72%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.8? 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件分別于制備后0、4、8、12、24、48 h測(cè)定，計(jì)算得苦參堿峰面積RSD=0.83%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.9? 加樣回收率試驗(yàn)

取苦參堿含有量已知的供試品溶液6份，精密加入苦參堿對(duì)照品適量，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，結(jié)果平均回收率為100.03%，RSD=1.85%，表明加樣回收率良好。

2.3? 浸膏得率測(cè)定

將50 mL醇提液精密吸取至已干燥恒定質(zhì)量的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干后放入105 ℃烘箱干燥3 h，置于干燥器冷卻30 min，迅速精密稱重，計(jì)算浸膏得率。浸膏得率（%）=浸膏質(zhì)量×供試品溶液體積÷（藥物飲片總質(zhì)量×移取供試品溶液體積）×100%。

2.4? 提取工藝優(yōu)選

以乙醇濃度、加醇倍量和提取時(shí)間為自變量，以鹽酸小檗堿、苦參堿和浸膏得率的綜合評(píng)分為因變量，根據(jù)評(píng)價(jià)指標(biāo)對(duì)醇提工藝的影響擬定權(quán)重，以各指標(biāo)綜合評(píng)分作為提取效果的評(píng)判依據(jù)。健脾祛濕丸方中黃柏為臣藥、苦參為佐藥，故給予鹽酸小檗堿40%權(quán)重，苦參堿和浸膏得率各給予30%權(quán)重，分別計(jì)算各指標(biāo)評(píng)分及綜合評(píng)分。指標(biāo)評(píng)分（%）=測(cè)得值÷最大值×權(quán)重×100%。綜合評(píng)分=鹽酸小檗堿評(píng)分+苦參堿評(píng)分+浸膏得率評(píng)分。

2.5? 單因素試驗(yàn)

2.5.1? 提取次數(shù)

稱取處方中擬醇提的藥物飲片30 g，將乙醇濃度固定為60%，加醇倍量固定為10倍，提取時(shí)間固定為1 h，依次考察提取1、2、3次，結(jié)果綜合評(píng)分呈遞增趨勢(shì)，故最佳提取次數(shù)為3次。

2.5.2? 乙醇濃度

稱取處方中擬醇提的藥物飲片30 g，將提取次數(shù)固定為1次，加醇倍量固定為10倍，提取時(shí)間固定為1 h，結(jié)果乙醇濃度為60%時(shí)，綜合評(píng)分最高，故將50%、60%、70%乙醇濃度作為響應(yīng)面設(shè)計(jì)范圍。

2.5.3? 加醇倍量考察

稱取處方中擬醇提的藥物飲片30 g，將提取次數(shù)固定為1次，乙醇濃度固定為60%，提取時(shí)間固定為1 h，結(jié)果加醇倍量為10倍量時(shí)，綜合評(píng)分最高，故將8、10、12加醇倍量作為響應(yīng)面設(shè)計(jì)范圍。

2.5.4? 提取時(shí)間

稱取處方中擬醇提的藥物飲片30 g，將提取次數(shù)固定為1次，乙醇濃度固定為60%，加醇倍量固定為10倍，當(dāng)提取時(shí)間為2 h時(shí)，綜合評(píng)分最高，故選提取時(shí)間1.5、2.0、2.5 h為響應(yīng)面設(shè)計(jì)范圍。

2.6? Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝

稱取處方中擬醇提的藥物飲片30 g，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，確定各因素的適宜范圍，提取次數(shù)固定為3次。以乙醇濃度（A）、加醇倍量（B）和提取時(shí)間（C）作為考察指標(biāo)進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)^[14]，試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。采用Design Expert 8.0.4軟件設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案，見(jiàn)表2。

2.6.2? 驗(yàn)證試驗(yàn)

通過(guò)數(shù)據(jù)分析得到的最佳提取工藝為：稱取處方中擬醇提的藥物飲片30 g，加入59.44%乙醇10.27倍，提取2.13 h。結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)，確定最佳工藝為：加入60%乙醇10倍，提取2 h。在最優(yōu)工藝下進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果鹽酸小檗堿、苦參堿平均質(zhì)量分別為25.48、38.59 mg，浸膏得率為29.10%，綜合評(píng)分為93.08%，與預(yù)測(cè)值（94.44%）接近，且鹽酸小檗堿轉(zhuǎn)移率為84.61%，苦參堿轉(zhuǎn)移率為76.02%，表明該模型預(yù)測(cè)性較好，可用于優(yōu)化健脾祛濕丸的醇提工藝。

3? 討論

本研究通過(guò)單因素試驗(yàn)考察多個(gè)因素水平，篩選出最佳提取方案，使進(jìn)入響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)的范圍縮小;以綜合評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，鹽酸小檗堿、苦參堿及浸膏得率為影響因素進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)與模型擬合，并對(duì)最優(yōu)提取工藝進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明該方法合理可行?？鄥A含量測(cè)定首先參照2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》（一部）苦參項(xiàng)下方法，結(jié)果有效成分無(wú)法分離。通過(guò)查閱大量文獻(xiàn)總結(jié)發(fā)現(xiàn)，甲醇-乙腈-磷酸鹽緩沖液流動(dòng)相較適合，故考察了9∶10∶72～15∶15∶80共12個(gè)比例，其中12∶12∶76條件下色譜峰分離度較好，且加入三乙胺溶液可減少拖尾，進(jìn)而考察了pH值對(duì)分離情況及峰形的影響，發(fā)現(xiàn)當(dāng)pH=6.8時(shí)結(jié)果最佳。制備供試品溶液時(shí)，為有效提取苦參總堿生物堿類成分，應(yīng)首先使生物堿游離，故采用先加濃氨水后加有機(jī)溶劑的方法;其次對(duì)提取溶劑進(jìn)行考察，分別篩選了飽和正丁醇、乙醚和三氯甲烷3種試劑，結(jié)果表明用三氯甲烷超聲處理的提取效率最高，故采用三氯甲烷作為提取溶劑。

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