基于均勻設(shè)計(jì)法的附子與甘草配伍減毒研究

賈真 劉艷彥

摘要：目的? 觀察附子、甘草不同配伍比例對(duì)附子毒性的影響，探索甘草與附子配伍減毒的最佳比例。方法 ?使用均勻設(shè)計(jì)表確定附子、甘草的配伍比例;以小鼠死亡率為指標(biāo)進(jìn)行附子、甘草不同配伍比例急性毒性評(píng)價(jià);多元線性回歸分析得到多元函數(shù)模型，針對(duì)函數(shù)模型求偏導(dǎo)數(shù)，得到附子、甘草最佳配比;比較附子及最佳配比附子、甘草的急性毒性，驗(yàn)證其減毒效果。結(jié)果? 隨著甘草劑量增加，小鼠死亡率整體呈下降趨勢(shì)。針對(duì)多元回歸分析得到的多元函數(shù)模型求偏導(dǎo)數(shù)得附子、甘草最佳配比為0.42∶1。附子半數(shù)致死劑量為30.9 g/kg，附子、甘草最佳配比最大耐受量為100 g/kg，小鼠死亡率為20%，附子毒性明顯減小。結(jié)論? 附子、甘草配伍比例對(duì)附子毒性有一定影響，從整體趨勢(shì)來看，隨著甘草劑量的增加，附子的毒性逐漸越小。

關(guān)鍵詞：附子;甘草;配伍;均勻設(shè)計(jì)法;小鼠

中圖分類號(hào)：R284.1;R285.5 ???文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A??? 文章編號(hào)：1005-5304（2019）02-0069-05

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.02.015

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract： Objective To observe the effects of different compatibility ratios of Aconiti Lateralis Radix Praeparata and Glycyrrhizae Radix et Rhizoma on toxicity of Aconiti Lateralis Radix Praeparata; To explore the best compatibility ratio of Aconiti Lateralis Radix Praeparata and Glycyrrhizae Radix et Rhizoma. Methods The compatibility ratios of Aconiti Lateralis Radix Praeparata and Glycyrrhizae Radix et Rhizoma were confirmed with uniform design method. Based on the mortality rate of mice， the acute toxicity of different compatibility ratios of Aconiti Lateralis Radix Praeparata and Glycyrrhizae Radix et Rhizoma was evaluated; Multiple linear regression analysis was used to obtain multivariate function model. Partial derivative for function model was used to obtain the best compatibility of Aconiti Lateralis Radix Praeparata and Glycyrrhizae Radix et Rhizoma; acute toxicity of Aconiti Lateralis Radix Praeparata and best compatibility of Aconiti Lateralis Radix Praeparata and Glycyrrhizae Radix et Rhizoma were compared， and its attenuation was verified. Results With the increase of Glycyrrhizae Radix et Rhizoma dosage， the mortality rate of mice was decreasing as a whole. The best ratio of Aconiti Lateralis Radix Praeparata and Glycyrrhizae Radix et Rhizoma obtained through partial derivative of multiple function model was 0.42：1. The lethal dosage of half Aconiti Lateralis Radix Praeparata was 30.9 g/kg. The maximal tolerable dose of best compatibility of Aconiti Lateralis Radix Praeparata and Glycyrrhizae Radix et Rhizoma was 100 g/kg. The mortality rate of mice was 20%. The toxicity of Aconiti Lateralis Radix Praeparata decreased significantly. Conclusion The compatibility of Aconiti Lateralis Radix Praeparata and Glycyrrhizae Radix et Rhizoma has certain effects on the toxicity of Aconiti Lateralis Radix Praeparata. From the overall trend， as the dosage of Glycyrrhizae Radix et Rhizoma increases， the toxicity of Aconiti Lateralis Radix Praeparata is smaller.

Keywords： Aconiti Lateralis Radix Praeparata; Glycyrrhizae Radix et Rhizoma; compatibility; uniform design; mice

附子為毛茛科植物烏頭Aconitum carmichaelii Debx.子根的加工品，有回陽救逆、補(bǔ)火助陽、散寒止痛功效^[1]，是中醫(yī)治療急癥重癥的代表藥。但附子有大毒^[2]，通過炮制、久煎等方法可降低其毒性?，F(xiàn)代藥理研究表明，附子化學(xué)成分中烏頭類生物堿是附子產(chǎn)生毒性作用的主要成分，同時(shí)也是發(fā)揮藥效的主要成分，炮制和久煎都會(huì)不同程度損失附子有效成分^[3-6]，從而影響療效。通過查閱古今文獻(xiàn)，我們發(fā)現(xiàn)附子常與甘草配伍使用，且甘草可使附子減毒存效。近年來，附子、甘草配伍的作用機(jī)制也成為研究熱點(diǎn)，包括對(duì)附子配伍甘草前后的化學(xué)成分、毒性、藥效、相態(tài)、代謝等研究^[7-15]，但關(guān)于附子、甘草配伍的作用機(jī)制仍未有定論。研究顯示，附子、甘草不同配伍比例對(duì)藥效有一定影響，從而推斷附子、甘草配伍的作用機(jī)制與用藥劑量和二藥配伍比例有關(guān)。關(guān)于附子、甘草配伍比例對(duì)附子毒性影響的研究表明，隨著甘草比例的增加，附子的毒性越來越低^{[9，14]}，但這些研究的配伍比例都是根據(jù)歷代醫(yī)家經(jīng)驗(yàn)設(shè)計(jì)。均勻設(shè)計(jì)是基于試驗(yàn)點(diǎn)在整個(gè)試驗(yàn)范圍內(nèi)均勻散布、從均勻性角度出發(fā)的一種試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，該方法試驗(yàn)次數(shù)少且均有代表性，因素的水平可多設(shè)，且實(shí)驗(yàn)結(jié)果可用計(jì)算機(jī)處理，在尋找最佳實(shí)驗(yàn)條件、最佳配比等方面是選擇優(yōu)化條件的有力工具^[16]。在中藥方面的應(yīng)用包括藥理研究和優(yōu)化中藥的提取工藝、制劑的成型工藝、組方配伍等^[17]。如王英豪等^[18]采用均勻設(shè)計(jì)法得出鉤吻和玉葉金花的最低毒性配伍比例。因此，本研究結(jié)合臨床用藥經(jīng)驗(yàn)，以及附子、甘草的急性毒性評(píng)價(jià)結(jié)果，確定附子和甘草的劑量范圍，使用均勻設(shè)計(jì)表確定附子、甘草不同配伍比例，以小鼠灌服藥液后的死亡率為指標(biāo)，觀察附子、甘草不同配伍比例對(duì)附子毒性的影響，并采用多元線性回歸分析探索附子與甘草的最佳配比。

1? 儀器、試藥和動(dòng)物

FA2204B電子天平（上海精科天美科學(xué)儀器有限公司），RV10 basic 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國IKAIKA公司），DLSB-5L/10低溫循環(huán)冷卻泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）。白附片（廣州市藥材公司中藥飲片廠，批號(hào)YPA7H0001），甘草（廣州至信中藥飲片有限公司，批號(hào)17080），甲醇（色譜純，廣州飛恩新材料科技有限公司），三乙胺（分析純），水為蒸餾水。

ICR小鼠210只，SPF級(jí)，18～22 g，雌雄各半，購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（粵）2013-0034。飼養(yǎng)于清潔級(jí)動(dòng)物房，室溫20 ℃，自由攝食飲水，隔日換墊料。

2? 方法與結(jié)果

2.1? 干浸膏制備

取藥物飲片適量，置于圓底燒瓶中，加入10倍量水，浸泡30 min，加熱回流提取2次合并。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（水浴鍋溫度為70 ℃）濃縮至一定程度，轉(zhuǎn)至蒸發(fā)皿，水?。?0 ℃）加熱蒸干，得干浸膏，稱重，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2? 附子、甘草急性毒性評(píng)價(jià)

2.2.1? 附子半數(shù)致死劑量測(cè)定

2.2.1.1? 預(yù)試驗(yàn)

ICR小鼠16只，雌雄各半，隨機(jī)分為4組，每組4只，按0.4 mL/10 g體質(zhì)量計(jì)算灌胃體積。附子干浸膏加水溶解至所需濃度，各組按設(shè)定的劑量分別灌胃給藥，給藥后立刻觀察小鼠出現(xiàn)的毒性反應(yīng)并記錄死亡數(shù)，找出引起0%死亡率和100%死亡率劑量的所在范圍。預(yù)試驗(yàn)結(jié)果表明，附子組無死亡劑量為10 g/kg，全致死劑量為80 g/kg。

2.2.1.2? 正式試驗(yàn)

ICR小鼠36只，雌雄各半，適應(yīng)性觀察3 d。實(shí)驗(yàn)前禁食不禁水16 h，隨機(jī)分為6組，每組6只，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果確定各組給藥劑量，組間距為0.6。按0.4 mL/10 g體質(zhì)量計(jì)算灌胃體積。附子干浸膏加水溶解至所需濃度，各組按設(shè)定的劑量分別灌胃給藥，給藥后立刻開始觀察小鼠神經(jīng)系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)的毒性反應(yīng)，記錄中毒潛伏期、開始出現(xiàn)死亡的時(shí)間、各組小鼠死亡數(shù)等，及時(shí)解剖死亡小鼠，記錄觀察到的變化。繪制小鼠死亡曲線，采用Bliss法計(jì)算半數(shù)致死劑量（LD₅₀）。

2.2.1.3? 小鼠中毒癥狀及附子半數(shù)致死劑量測(cè)定結(jié)果

小鼠給藥后出現(xiàn)身體顫抖、惡心干嘔、行動(dòng)遲緩的癥狀，繼而精神萎靡、怠動(dòng)、俯臥不動(dòng)。死亡前全身顫抖、怠動(dòng)無力、呼吸急促，部分小鼠出現(xiàn)驚厥。動(dòng)物死亡多發(fā)生在給藥后0～4 h內(nèi)，對(duì)死亡動(dòng)物進(jìn)行解剖，發(fā)現(xiàn)肝臟邊緣發(fā)黃或發(fā)黑，部分小鼠脾臟或者心臟略有發(fā)黑。給藥24 h后無小鼠死亡，小鼠逐漸恢復(fù)正常狀態(tài)。不同劑量引起小鼠死亡數(shù)見表1，附子LD₅₀為30.9 g/kg，95%置信區(qū)間為21.4～45.1 g/kg。

2.2.2? 甘草最大耐受量測(cè)定

2.2.2.1? 預(yù)試驗(yàn)

ICR小鼠10只，雌雄各半，按0.4 mL/10 g體質(zhì)量計(jì)算灌胃體積。以最大濃度0.75 g/mL甘草灌胃1次，觀察7 d，無死亡出現(xiàn)。

2.2.2.2? 正式試驗(yàn)

ICR小鼠40只，雌雄各半，隨機(jī)分為對(duì)照組和給藥組，每組20只，計(jì)算灌胃體積，給藥組1 d內(nèi)給予最大給藥量（0.75 g/mL×0.4 mL/10 g），對(duì)照組給予等體積水，灌胃3次。觀察7 d，測(cè)定最大耐受量（MTD）。小鼠給藥后未出現(xiàn)異?；顒?dòng)，解剖結(jié)果也未見異常情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，甘草MTD為90 g/kg。

2.3? 附子、甘草配伍比例確定

2.3.1? 附子、甘草給藥劑量確定

按急性毒性評(píng)價(jià)結(jié)果，附子給藥量最小值為LD₅₀，最大值為2×LD₅₀;甘草給藥量最小值為臨床用藥的低劑量，最大值為MTD。最終確定附子給藥劑量為30～60 g/kg，甘草給藥劑量為1～90 g/kg。

2.3.2? 因素與水平的確定

根據(jù)均勻設(shè)計(jì)U7*（7⁴）表，將附子、甘草給藥劑量分別作為考察因素1、因素2，每個(gè)因素分別取7個(gè)水平，附子與甘草劑量見表2，劑量配比見表3。

2.4? 不同配伍比例附子、甘草毒性評(píng)價(jià)

2.4.1? 不同配伍比例附子、甘草水煎液毒性測(cè)定

ICR小鼠70只，雌雄各半，適應(yīng)性觀察3 d。實(shí)驗(yàn)前禁食不禁水16 h，隨機(jī)分為7組，每組10只。各組小鼠灌胃給藥2次，按試驗(yàn)方案將配制藥液全部灌完。給藥后立刻開始觀察小鼠神經(jīng)系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)的毒性反應(yīng)，中毒癥狀發(fā)生的時(shí)間、持續(xù)時(shí)間、恢復(fù)情況，對(duì)死亡小鼠及時(shí)進(jìn)行大體解剖觀察，記錄所觀察到的變化，統(tǒng)計(jì)各組小鼠死亡數(shù)并比較各組死亡率。7 d后將全部小鼠處死并解剖觀察，記錄所觀察到的變化。

2.4.2? 附子、甘草不同配伍比例毒性試驗(yàn)結(jié)果

小鼠死亡多發(fā)生在給藥后0～12 h內(nèi)，解剖發(fā)現(xiàn)肝臟邊緣發(fā)黃或發(fā)黑，部分小鼠脾臟或心臟略有發(fā)黑。給藥24 h后，無小鼠死亡，小鼠逐漸恢復(fù)正常狀態(tài)。附子、甘草不同配伍比例毒性試驗(yàn)結(jié)果見表4，附子、甘草不同配伍比例各組小鼠死亡曲線。結(jié)果顯示，附子配伍甘草后對(duì)小鼠的毒性降低。

2.5? 附子、甘草不同配伍比例小鼠死亡率分析

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)均勻試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元線性回歸分析，建立多元函數(shù)及F檢驗(yàn)。得多元函數(shù)模型Y=70.576-1.635F-1.455G+0.032F²+0.012G²（Y表示死亡率，F(xiàn)表示附子，G表示甘草），應(yīng)用相關(guān)系數(shù)R評(píng)價(jià)函數(shù)模型，R=0.985，R²=0.97，調(diào)整R²為0.91。該回歸方程經(jīng)F檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.059），見表5。針對(duì)函數(shù)模型求偏導(dǎo)數(shù)，求得最佳配比為附子∶甘草為0.42∶1。

2.6? 附子、甘草最佳配伍比例減毒效果評(píng)價(jià)

2.6.1? 預(yù)試驗(yàn)

ICR小鼠16只，雌雄各半，按0.4 mL/10 g體質(zhì)量計(jì)算灌胃體積。各組按設(shè)定的劑量分別灌胃給藥，找出引起0%死亡率和100%死亡率劑量所在范圍。預(yù)試驗(yàn)結(jié)果表明，附子、甘草最佳配比為0.42∶1，受給藥體積和給藥濃度限制，無法測(cè)出LD₅₀，但小鼠給藥后出現(xiàn)毒性反應(yīng)，故改測(cè)MTD。

2.6.2? 正式試驗(yàn)

ICR小鼠22只，雌雄各半，適應(yīng)性觀察3 d。實(shí)驗(yàn)前禁食不禁水16 h，隨機(jī)分為2組，對(duì)照組7只，給藥組15只，按0.4 mL/10 g體質(zhì)量計(jì)算灌胃體積。對(duì)照組灌胃給水2次，給藥組按附子、甘草最佳配比組灌胃給藥2次，給藥間隔時(shí)間均為6 h。給藥后立刻開始觀察小鼠神經(jīng)系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)的毒性反應(yīng)，記錄中毒潛伏期、開始出現(xiàn)死亡的時(shí)間、死亡只數(shù)等，及時(shí)解剖死亡小鼠，記錄觀察到的變化。14 d后，全部小鼠進(jìn)行解剖，記錄觀察到的變化。

2.6.3? 附子、甘草最佳配比最大耐受量測(cè)定結(jié)果

小鼠給藥后出現(xiàn)身體顫抖、惡心干嘔、行動(dòng)遲緩的癥狀，繼而精神萎靡、怠動(dòng)、俯臥不動(dòng)。小鼠死亡前全身顫抖、怠動(dòng)無力、呼吸急促。動(dòng)物死亡發(fā)生在第2次給藥4 h后，解剖發(fā)現(xiàn)肝臟邊緣發(fā)黃或發(fā)黑，部分小鼠脾臟或心臟略有發(fā)黑。小鼠第2次給藥24 h后漸漸恢復(fù)正常。14 d后將所有小鼠處死，解剖，發(fā)現(xiàn)部分小鼠胸腔內(nèi)有瘀血，肝臟、腎臟顏色均較淺。給藥組小鼠死亡3只，死亡率為20%。通過計(jì)算，得到小鼠日MTD為100 g/kg，MTD倍數(shù)相當(dāng)于體質(zhì)量60 kg成人臨床每日劑量的133.33倍。

3? 討論

附子作為回陽救逆第一要藥，在中醫(yī)臨床急危重癥的救治中具有非常重要的地位，尤其隨著近年“扶陽學(xué)派”興起，附子在臨床廣泛而大量使用，其劑量的選擇常超出藥典規(guī)定劑量，如何在保持附子藥效的同時(shí)減少其對(duì)機(jī)體的毒副作用成為亟待解決的問題。配伍甘草為附子減毒方法之一，關(guān)于配伍比例研究在文獻(xiàn)中常見的有附子、甘草為1∶1的比例，有部分文獻(xiàn)探討了配伍比例對(duì)附子毒性的影響，但僅局限于1∶2、1∶1、2∶1不同比例，而藥物比例對(duì)復(fù)方或藥對(duì)的藥效或毒性的影響作用十分重要。本研究中不同配伍比例的附子、甘草毒性評(píng)價(jià)結(jié)果表明，附子與甘草配伍后，小鼠死亡率降低，且隨著甘草配伍比例增加，小鼠死亡率呈現(xiàn)“降升交替”的現(xiàn)象，但整體趨勢(shì)是下降的。本實(shí)驗(yàn)采用均勻設(shè)計(jì)法對(duì)附子、甘草配伍比例對(duì)附子毒性進(jìn)行了優(yōu)化研究，結(jié)果0.42∶1附子與甘草配比為最佳比例;附子與甘草按照0.42∶1配伍使用后，附子毒性大大降低，MTD是附子LD₅₀3倍多，且小鼠死亡率低，說明該配比減毒效果好。

本研究發(fā)現(xiàn)，附子配伍甘草后小鼠的死亡時(shí)間推后，附子單用時(shí)，小鼠死亡多集中在給藥后4 h內(nèi)，而配伍甘草后小鼠死亡時(shí)間多集中在給藥后4～12 h內(nèi)，說明甘草可緩附子之性急和性毒，符合章津銘^[19]從“藥理-化學(xué)-藥代”相結(jié)合層面，初步揭示附子配伍甘草“毒減而效不減”作用機(jī)制——基于兩者煎煮過程，甘草成分與附子毒（效）成分形成復(fù)合物而逐漸沉積于湯液底部，在湯液溫服條件下游離態(tài)和結(jié)合態(tài)的毒（效）成分均進(jìn)入機(jī)體，結(jié)合態(tài)成分在胃腸道中緩慢釋放，從而實(shí)現(xiàn)毒（效）組分的不同步吸收，“緩吸收之急而解其毒，延吸收之時(shí)而增其效”。中毒死亡小鼠解剖結(jié)果顯示，附子對(duì)肝臟、心臟、脾臟具有毒性，尤其肝臟。肝臟是體內(nèi)重要的代謝器官，含有大部分代謝酶，其中CYP3A4為烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿的主要代謝酶。有研究表明，附子水煎液對(duì)大鼠CYP3A4有誘導(dǎo)作用，從而使CYP3A4被酶解，影響肝臟代謝^[20]，這也可以解釋中毒死亡的小鼠為何肝臟邊緣發(fā)黃發(fā)黑。

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