牦牛大片吸蟲的形態(tài)觀察及ＰＣＲ鑒定

孔祥穎 甘富斌 高興 張文華 蔡金山 李家奎

摘要：肝片吸蟲病是一種由肝片吸蟲和大片吸蟲寄生于人和牛、羊等反芻動(dòng)物的肝臟膽管所致的人畜共患寄生蟲病。于2017年在青海省海北州某屠宰場(chǎng)進(jìn)行牦牛寄生蟲病調(diào)查時(shí)，在患病牦牛肝臟采集到吸蟲樣本，經(jīng)蟲體形態(tài)學(xué)觀察、PCR鑒定，查明該蟲體為大片吸蟲，該研究為首次報(bào)道牦牛大片吸蟲，可為牦牛該病的防治提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：牦牛;大片吸蟲;形態(tài)觀察;PCR鑒定

中圖分類號(hào)：S852.73+5? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? 文章編號(hào)：1007-273X（2019）01-0005-02

肝片形吸蟲病是一種以肝片吸蟲和大片吸蟲為病原的重要的人畜共患寄生蟲病，主要寄生于動(dòng)物的肝臟、膽管、膽囊中，以破壞動(dòng)物肝臟、膽管而引起急性、慢性肝炎和膽管炎[1]，并使患病動(dòng)物伴有貧血、水腫、食欲不振、全身性中毒等癥狀，輕者可導(dǎo)致患病動(dòng)物消瘦，重者可導(dǎo)致患病動(dòng)物大批死亡，給養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[2，3]。

牦牛主要分布于我國(guó)的青藏高原及毗鄰地區(qū)，適應(yīng)高寒生態(tài)條件，耐粗、耐勞，善走陡坡險(xiǎn)路、雪山沼澤，能游渡江河激流，有“高原之舟”之稱[4，5]。當(dāng)牦牛采食沼澤、潮濕、坑洼等草地的牧草時(shí)，容易感染肝片吸蟲病，造成牦牛大量死亡，給牧民帶來(lái)較大的經(jīng)濟(jì)損失[6，7]。筆者在青海患肝片吸蟲病牦牛身上采集到蟲體樣本，經(jīng)壓片觀察、PCR鑒定后，確認(rèn)為牦牛大片吸蟲，該研究將為牦牛大片吸蟲病的診斷提供參考[2，8，9]。

1? 材料與方法

1.1? 試驗(yàn)用蟲體來(lái)源

2017年自青海海北州某屠宰場(chǎng)進(jìn)行牦牛寄生蟲病調(diào)查時(shí)，在牦牛肝臟中采集到蟲體樣本，疑似肝片吸蟲，經(jīng)95%的乙醇固定，待檢。

1.2? DNA提取

將蟲體用研缽磨碎，加入裂解液使細(xì)胞充分裂解，用氯仿提取DNA，以氮吹儀吹干，最后再溶解，于4 ℃保存。

1.3? PCR方法

擴(kuò)增的引物是Itagaki等所發(fā)表的引物，上游引物為5′_AAGGATGTGCTTTGTCGTGG_3′，下游引物為5′_AGGCCCCTTACGAATCTGCAT_3′。反應(yīng)體系為25 μL，其中蒸餾水5.5 μL，Mix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，模板DNA 5 μL。擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃后延伸5 min。取5 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，觀察并記錄結(jié)果。最后將擴(kuò)增產(chǎn)物送到擎科生物科技有限公司測(cè)序，并將測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行比對(duì)。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 牦牛大片吸蟲的形態(tài)觀察

眼觀和顯微鏡觀察，牦牛大片吸蟲蟲體長(zhǎng)37～76 mm、寬5～10 mm，竹葉狀。與肝片形吸蟲的區(qū)別在于：前者前端無(wú)顯著的圓錐突出，在頭部后面即逐漸擴(kuò)大直至腹吸盤水平處，蟲體的邊幾成平行，后端不縮小;腹吸盤較大，其腔通常向后延長(zhǎng)，并形成盲囊。大片形吸蟲的咽較食道長(zhǎng)，腸管的內(nèi)側(cè)分支很多，并有明顯的小支，睪丸分支較少，所占的空間及其長(zhǎng)度較小。牦牛大片吸蟲形態(tài)和報(bào)道的大片吸蟲形態(tài)相似[10]。

2.2? 測(cè)序結(jié)果及NCBI GenBank比較

經(jīng)擴(kuò)增得到514 bp的片段，G+C含量為38.3%。同NCBI GenBank已發(fā)表的序列進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，與KF543343.1、MF430857.1等相似度達(dá)到99%，與KF687892.1相似度更是高達(dá)100%（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov）[11]?？梢源_定該蟲體樣本為大片吸蟲。

3? 討論

牦牛肝片吸蟲病是由肝片吸蟲和大片吸蟲引起的一種寄生蟲病，嚴(yán)重影響牦牛的生長(zhǎng)發(fā)育，甚至引起大批死亡[12，13]。該病在我國(guó)牦牛產(chǎn)區(qū)十分常見，常造成較大的經(jīng)濟(jì)損失[14]。但在以往的報(bào)道中，肝片吸蟲病多由肝片吸蟲引起，大片吸蟲少有報(bào)道。目前已見報(bào)道的牛的大片吸蟲僅有水牛，本試驗(yàn)證實(shí)了牦牛體內(nèi)大片吸蟲的存在，為牦牛大片吸蟲的診治奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 宋銘忻，張龍現(xiàn).獸醫(yī)寄生蟲學(xué)[M].北京：科學(xué)出版社，2009.

[2] 高? 燕，張? 濤，楊紅生，等.鑿貝才女蟲形態(tài)與結(jié)構(gòu)觀察[J].海洋科學(xué)，2011，35（10）：103-109.

[3] 李國(guó)清.獸醫(yī)寄生蟲學(xué)：雙語(yǔ)版[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2006.

[4] LI K，GAO J，SHAHZAD M，et al. Seroprevalence of Toxoplasma gondii infection in yaks （Bos grunniens） on the Qinghai-Tibetan Plateau of China[J].Veterinary Parasitology，2014，205（1-2）：354-356.

[5] ZHANG X X，F(xiàn)ENG S Y，MA J G，et al. Seroprevalence and risk factors of fascioliasis in Yaks，Bos grunniens，from three counties of Gansu province，China[J].Korean Journal of Parasitology，2017，55（1）：89-93.

[6] 黃維義，董世娟，楊曉野，等.我國(guó)片形吸蟲線粒體NADH脫氫酶亞單位1基因（nad1）多態(tài)性的研究[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2005，27（4）：273-276.

[7] 黃維義，何? 波.酶切圖譜及序列分析蟲體ITS2鑒別中國(guó)的片形吸蟲[J].動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)，2002，19（10）：2-6.

[8] 李樹榮，普? 磊，楊? 燦，等.云南省新平縣鵝五種寄生蟲形態(tài)觀察[J].中國(guó)動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào)，2003，11（2）：43-44.

[9] 王裕卿.犬體胞囊?guī)Ы{蟲形態(tài)結(jié)構(gòu)研究[J].中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)，1992（12）：17-18.

[10] 尹懷志，黃進(jìn)華，汪序欽.巨片吸蟲生活史各期蟲體的掃描電鏡觀察[J].福建師范大學(xué)學(xué)報(bào)，1989，5（1）：65-71.

[11] ITAGAKI T，TSUTSUMI K I，ITO K，et al. Taxonomic status of the Japanese triploid forms of Fasciola：comparison of mitochondrial ND1 and COI sequences with F. hepatica and F. gigantica[J].Journal of Parasitology，1998，84（2）：445-448.

[12] 柴正明.青海興海牦牛肝片吸蟲感染情況調(diào)查[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志，2012，48（12）：43-44.

[13] 殷銘陽(yáng)，周東輝，劉建枝，等.中國(guó)牦牛主要寄生蟲病流行現(xiàn)狀及防控策略[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2014，41（5）：227-229.

[14] 何山紅，班克滿，郭亞芬，等.廣西欽州市郊區(qū)水牛大片吸蟲感染情況調(diào)查分析[J].廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，41（11）：1237-1239.